Prostat Kanseri Hücrelerinde Nobiletin Flavonoidinin TLR4 ve TLR9 Reseptörleri Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

Abstract

ÖZET Toll-benzeri reseptörler (TLR'ler) epitelyal, immün ve kanser hücrelerinde eksprese edilen iyi bilinen bir patern tanıma reseptörü ailesidir. Nobiletin, kanser karşıtı özelliklere sahip ve prostat kanseri riskini azalttığı bildirilen bir O-metillenmiş flavonoiddir. Bu çalışmada Nobiletinin etkileri TLR4 ve TLR9 üzerinde PC-3, LNCaP ve HUVEC hücre hatlarında araştırılmıştır. LPS (lipopolisakkarit) ve CpG-ODN (CpG oligodeoksinükleotid) sırasıyla TLR4 ve TLR9 sitümülasyonu için kullanılmıştır. Hücre canlılığı WST-1 ile analiz edilmiştir. Nobiletinin inhibe edici konsantrasyonu (IC50) LNCaP için 20 µM, PC-3 ve HUVEC için 40 µM olarak bulunmuştur (p<0.05). JElatinaz aktivitesi ve protein ekspresyonu sırasıyla zimografi ve western blot ile analiz edilmiştir. MMP-2 ve MMP-9 jelatinaz aktivitesi PC-3 ve LNCaP için düşük bulunmuştur. MMP-2 aktivitesi HUVEC için yüksek bulunmasına rağmen, MMP-9 aktivitesi gözlenmemiştir (p<0.05). Aynı zamanda Nobiletinin TLR4 ve IRF3 protein miktarını azalttığı bulunmuştur (p<0.05). TLR4 ve TLR9 gen ekspresyonu Gerçek Zamanlı Kantitatif Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ile analiz edilmiştir. Nobiletin'in TLR4 ve TLR9 gen ekspresyonunu azalttığı LNCaP hücrelerinde gözlenmiştir (p<0.05). Sitokinler (INF-α ve INF-β) Enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile analiz edilmiştir. Nobiletinin INF-α ve INF-β miktarını LNCaP hücrelerinde azalttığı bunmuştur (p<0.05). TLR4 ve TLR9 sinyal yolaklarını Nobiletinin özellikle LNCaP hücrelerinde baskıladığı gözlenmiştir. Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, Nobiletinin etkisinin AR- bağımlıdır ve TLR4 ve TLR9 sinyal yolakları üzerinde baskılayıcı bir etki göstermektedir. Araştırmamız büyük potansiyeli olan TLR4 ve TLR9 sinyal yolaklarının yeni tedavi yaklaşımları için önemli olduğunu göstermiştir ve çalışmamız yeni projeler için prostat kanseri, Nobiletin ve TLR’ler arasındaki ilişkide moleküler mekanizmanın varlığını göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Prostat Kanseri, TLR4, TLR9, Flavonoid, Nobiletin

ABSTRACT Toll-like receptors (TLRs) are a well-known family of pattern recognition receptors that expressed in epithelial, immune and cancer cells. Nobiletin is an O-methylated flavonoid that possesses anti-cancer properties and has been reported to reduce the risk of prostate cancer. In this study we investigated the effects of nobiletin on TLR4 and TLR9 in LNCaP, PC-3 and HUVEC cell lines. Lipopolysaccharide (LPS) and CpG-ODN (CpG-oligodinükleotid) were used for TLR4 and TLR9 stimulation, respectively. Cell viability was analyzed with WST-1 assay. Inhibitory concentrations (IC50) of Nobiletin were found 20 µM for LNCaP and 40 µM for PC-3 and HUVEC (p<0.05). Gelatinase activity and protein expression were examined by zymography and western blotting, respectively. Gelatinase activity of MMP-9 and MMP-2 was found low in PC-3 and LNCaP, although there was high MMP-2 activity in HUVEC, MMP-9 activity was not observed (p<0.05). Also it was found that Nobiletin reduced TLR4 and IRF3 protein levels in LNCaP and PC-3 (p<0.05). TLR4 and TLR9 gene expression was examined by Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). It was observed that Nobiletin decreased TLR4 and TLR9 gene expression in LNCaP (p<0.05). Cytokines (INF-α and INF-β) were analyzed with EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISA). It was found that Nobiletin reduced the amount of INF-α and INF-β in LNCaP (p<0.05). It is observed that TLR4 and TLR9 signaling pathway is suppressed by Nobiletin especially LNCaP cells. When all the results are evaluated together; the effect of Nobiletin is AR-dependent and shows a reducing effect on TLR4 and TLR9 signaling pathway. Our research showed that TLR4 and TLR9-dependent signaling pathway with great potential is important for new therapeutic approaches and our research demonstrated that molecular mechanism of the relationship between prostate cancer, Nobiletin and TLRs for prospective projects. Keywords: Prostate Cancer, TLR4, TLR9, Flavonoides, Nobiletin