Isı şok protein 10 (HSP10)’un mezenkimal kök hücrelerin immünmodülasyonundaki rolünün araştırılması

Abstract

Bu tez çalışması kapsamında, Isı şok protein 10 (Hsp10)'un Mezenkimal kök hücrelerin (MKH) immünomodülasyonundaki rolü araştırıldı. Hücrelerin karakterizasyonu için stromal belirteçlerin ifadelerine ve farklılaşmalarına bakıldı. Kİ-MKH'nın ve PL-MKH'nın aktive edilmiş T hücre proliferasyonu üzerindeki immünomodülatör etkilerini araştırmak için CD3 + T hücreleri izole edildi. L-PHA ile uyarılmış ve CFSE etiketli T hücreleri BM-MSC'ler veya PL-MSC'ler ile birlikte kültürlendi. IFNγ, LPS ve ısı şokuna maruz bırakılan BM-MSC'lerin süpernatanlarında Hsp10 seviyeleri, ELISA ile değerlendirildi; EGF / Hsp10'un hücre içi ifadesi Western-Blot ve immünohistokimyasal boyamalar kullanılarak değerlendirildi. CD105, CD73, CD90, CD44, CD29, MSC'lerin immünofenotiplenmesi için stromal belirteçler olarak kullanılmış ve akış sitometrisi (FACS) kullanılarak ölçülmüştür.Yüzey belirteçlerinin ve immünomodülatör moleküllerin ekspresyonunda Kİ-MKH ve PL-MKH arasında anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Genel olarak, Kİ-MKH'lar PL-MKH'lardan daha yüksek bir farklılaşma kapasitesine sahip olduğu gösterildi. PL-MKH'lar, T-hücresi genişlemesini Kİ-MKH'lara göre daha az baskılayabildiği gözlemlendi. Çeşitli uyaranların uygulanmasından sonra hücre kültürü süpernatantına PL-MKH ve Kİ-MKH'lardan Hsp10 salgılanması, algılama seviyelerinin altında kaldı. Bu veriler, PL-MKH'lerin hem diferansiyasyon hem de immün baskılayıcı kapasitelerinin göreli safsızlık nedeniyle engellendiği fikrini desteklemektedir. Sonuç olarak, FACS, Western Blot, ELISA ve immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak, hem Kİ-MKH hem de PL-MKH'lerde, Hsp10'un protein katlama ve transportunda hücre içi olarak önemli rol ile tutarlı olarak yüksek Hsp10 seviyelerinin saptanmış olduğu gösteridi, ancak bu protein, uygulanan uyaranların herhangi birine yanıt olarak salgılanmadığından, Hsp10'un Kİ-MKH'larda ve PL-MKH'larda önemli bir immünorülasyon işlevine sahip olma ihtimalinin olmadığını göstermektedir.

In this thesis, the role of heat shock protein 10 (Hsp10) in the immunomodulation of mesenchymal stem cells (MSC) was investigated. Cells were characterized and assessed for expression of stromal markers and differentiation. CD3+ T-cells were isolated in order to investigate the immunomodulatory effects of BM-MSC and PL-MSC on activated T-cell proliferation. L-PHA-stimulated and CFSE-labeled T-cells were co-cultured with BM-MSCs or PL-MSCs. Hsp10 levels in supernatants of BM-MSCs exposed to IFNγ, LPS and heat shock were assessed by ELISA; intracellular expression of EGF/Hsp10 was assessed using Western-Blot and immunohistochemical stainings. CD105, CD73, CD90, CD44, CD29 were used as stromal markers for immunophenotyping of MSCs and measured using flow cytometry (FACS). No significant differences between BM-MSC and PL-MSC were observed in the expression of surface markers and immunomodulatory molecules. Overall, BM-MSCs showed a higher differentiation capacity than PL-MSCs. PL-MSCs were less able to suppress T-cell expansion than BM-MSCs. Secretion of Hsp10 from PL-MSC and BM-MSCs into the cell culture supernatant after application of various stimuli remained below detection levels. These data support the idea that both differentiation and immune suppressive capacities of PL-MSCs were hampered because of the relative impurity. In conclusion, using FACS, Western Blot, ELISA and immunohistochemical methods, we showed that although high levels of Hsp10 were detected intracellularly in both BM-MSC and PL-MSCs, which is consistent with the important role for Hsp10 intracellularly in protein folding and transport, but since this protein was not secreted in response to any of the stimuli applied, indicating that it is unlikely that Hsp10 has an important immunoregulatory function in BM and PL-MSCs.