Sakaryada yetişen iki farklı kabak çekirdeğinden (cucurbita maxima ve moschata) katalaz enziminin karakterizasyonu

Abstract

Katalaz (Hidrojen Peroksit Oksiredüktaz, E.C: 1.11.1.6), hidrojen peroksitin suya dönüşmesini sağlar ve prostetik grup olarak hem grubu içerir. Ayrıca katalaz omurgalı ve omurgasız hayvanlarda, bitkilerde ve mikroorganizmalarda mevcut olup yüksek bir turnover sayısına (4x 107 s-1) sahiptir. Katalaz önemli bir antioksidan savunma sistemi bileşeni olup, hidrojen peroksitin suya dekornposizyonunu katalizler.Bu çalışmada katalaz enzimi Sakarya'da yetiştirilen iki farklı kabak çekirdeğinden (Cucurbita maxima ve Cucurbita moschata) saflaştırılarak kinetik özellikleri incelenmiştir. Öncelikle enzim homojenatı uygun tampon çözeltileri kullanılarak elde edilimiş ve ardından amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri uygulanmıştır.Diyalizden elde edilen protein sephadex G-100 kolon kromotogrofisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Enzimin molekül ağırlığını belirlemek amacıyla SDS-PAGE elektroforez uygulanmıştır. Kabak çekirdeklerinden elde edilen katalaz enzimleri için hidrojen peroksit substratı kullanılarak 240 nm'de UV?Vis spektrofotometre cihazında absorbans azalmasının takibi ile Km ve Vmax değerleri elde edilmiştir. Cucurbita maxima için Km= 17,68 mM, Vmax = 81,300 EÜ / mL; Cucurbita moschata için Km = 20,029 mM, Vmax = 58,139 EÜ / mL olarak hesaplanmıştır. Enzim için optimum pH, optimum sıcaklık değerleri sırasıyla 6,8-7,0 ve 25 °C olarak bulunmuştur. Enzimlerin molekül ağırlıkları elektroforez kullanılarak hesaplanmıştır. Her iki kabak çekirdeği katalazı için 60 kDa ile 8 kDa arasında üç bant gözlemlenmiştir. Ayrıca siyanür ve azid gibi hem inhibitörlerinin enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edilmiş ve inhibitörlerin KI değerleri hesaplanmıştır. Her iki çekirdek içinde azit KI = 0,66 0,04 ; siyanür KI = 2,42 0,01 olarak hesaplanmştır.Anahtar kelimeler: Kabak çekirdeği, Cucurbita maxima, Cucurbita moscahata, antioksidant enzimler, katalaz, antioksidan sistemler, hidrojen peroksit.

.Catalase (Hydrojen Peroxide Oxidoreductase, E.C: 1.11.1.6), converts hydrogen peroxide to water and contains heme as prostethic groups. In addition, catalase exist, in vertebrates, in vertebrates animals, plants and microorganisms with a high turnover number (4x 107 s-1). Catalase is a major primary antioxidant defense component that primarily works to catalase the decomposition of Hydrogen Peroxide to water.In this study, catalase was purified from cucurbita seeds (Cucurbita maxima and Cucurbita moschata) and some kinetic properties were studied. The purification was performed at three steps: Preparation of homogenate , ammonium sulphate fractionation and after dialysis, the enzymes were applied to G-100 sephadex column chromatography system. SDS - PAGE electrophoresis was applied for the determination of the enzymes molecular weights. They were found in three bands from 60 to 8 kDa in the electrophoresis for both seeds. Optimum pH, optimum temperature of the enzymes were found to be 6,8 ? 7,0 and 25 °C. Km and Vmax values were calculated. Cucurbita maxima Km=17,68 mM Vmax=81,300 EÜ/mL ; Cucurbita moschata Km=20,029 mM, Vmax=58,139 EÜ/mL. In addition to that, Heme catalase inhibitors, such as azide and cyanide, inhibited the enzyme activity markedly and KI values were calculated. For Cucurbita maxima and moschata azide KI = 0,66 0,04 ; cyanide KI = 2,42 0,01.Key words: Cucurbita seeds, Cucurbita maxima, Cucurbita moscahata, antioxidant enzymes, Catalase,, antioxidant system, hydrogen peroxide