Sakarya bölgesinde yetişen devedikeni (silybum marianum) bitkisinden peroksidaz enziminin karakterizasyonu

Abstract

Peroksidaz (POD; EC 1.11.1.7), akseptör olarak rol yapan hidrojen peroksitin ve hidrojen atomlarının donörü olarak rol yapan başka bir bileşiğin de bulunduğu bir reaksiyonu katalize eden bir oksidoredüktazdır.Bu çalışmada peroksidaz enzimi (POD), Sakarya bölgesinde yetişen deve dikeni (Silybum marianum) bitkisinin hem gövde hem de çiçek tablası kısmından ekstrakte edilmiş ve amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, jel filtrasyon kromotografisi yöntemleri ile kısmen saflaştırılmıştır. Elde edilen ekstrakte, peroksidaz enziminin karakterizasyonu için kullanılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarında 4-metil katekol ? H2O2, ABTS - H2O2, guaiakol - H2O2, kafeik asit - H2O2, o-dianisidin - H2O2, o-fenilen diamin - H2O2, progallol - H2O2, katekol - H2O2 substrat çiftleri kullanılarak her bir substrat için ayrı ayrı optimum pH ve sıcaklık değerleri belirlenmiştir. Her bir substrat çifti için 420 nm'de UV spektrofotometre cihazında aktivite tayinleri yapılmıştır. Enzimin optimum sıcaklığı ve optimum pH bu sekiz substrat çifti kullanılarak belirlenmiştir. Enzimin optimum pH'ı 3,0 ? 9,0 arasında değiştiği bulunmuştur. enzimin optimum sıcaklığı ise 30 ? 40 °C arasında değiştiği bulunmuştur. Ayrıca her bir substrat çifti için Lineveawer-Burk grafiklerinden Km ve Vmax değerleri ayrı ayrı hesaplanmıştır. Km değerleri değerlendirilerek POD substrat spesifikliği bulunmuştur. Peroksidaz enziminin substrat spesifikliği gövde kısmı için büyükten küçüğe doğru o-fenilen daimin, progallol, o-dianisidin, kafeik asit, ABTS 4-metil katekol, katekol ve guaiakol sırasını takip ederken çiçek tablası kısmı için ise o-dianisidin, kafeik asit, progallol, ABTS, o-fenilen daimin, katekol, 4-metil katekol ve guaiakol sırasını takip etmiştir. Bu çalışmada sekiz adet inhibitör ile çalışılmış olup etkili olanların yarışmalı inhibitör olarak sodyum azid, tiyoüre, askorbik asit, 2-merkapto etanol, L-Glutatyon ve L-Sistein, yarı yarışmalı olarak potasyum siyanür, yarışmasız olarak ise sodyum sülfit olduğu bulunmuştur. Bunun yanında çalışmalarımızda peroksidaz enzimi aktivitesi üzerine etki eden Fe+3, Cu+2, Zn+2, Mg+2, Hg+2, Ba+2, Ca+2, Li+1, Co+2, Mn+2, Pb+2, Sn+2, Na+1, K+1, Ni+2 ve Cd+2 metalleri incelenmiştir. Peroksidaz enzimi üzerine etki eden metallerden sadece Cu+2, Sn+2 ve K+1'in enzim üzerinde inhibisyona diğer metallerin ise aktivasyona sebeb oldukları görülmüştür.Anahtar kelimeler: Peroksidaz, deve dikeni, Silybum marianum, antioksidan enzimler, serbest radikaller, antioksidant savunma

Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) is an oxidoreductase that catalyses a reaction in which hydrogen peroxide acts as the acceptor and another compound acts as the donor of hydrogen atoms.In this work, Milk thistle (Silybum marianum) was used for POD characterization. Milk thistles were harvested fresh from the region of Sakarya, in Turkey. This extract purified partly through (NH4)2SO4 precipitation, dialysis, gel filtration. POD activity was determined by measuring as indicated by an increase in absorbance at 420 nm. Enzyme activity, as a function of pH, was determined with substrate patterns (catechol - H2O2, 4-methylcatechol - H2O2, pyrogallol - H2O2, caffeic acid - H2O2, ABTS - H2O2, guaiacol - H2O2, o-dianisidine - H2O2, o-phenilen diamin - H2O2), in different buffer, ranging from pH 3,0 to 9,0. Enzyme activity, as a function of temperature, was determined with substrate patterns. Optimum temperature was found to change between 30 ? 40 °C. Michaelis-Menten constant (Km) and maximum reaction velocity (Vmax) were determined using eight substrate patterns (catechol - H2O2, 4-methylcatechol - H2O2, pyrogallol - H2O2, caffeic acid - H2O2, ABTS - H2O2, guaiacol - H2O2, o-dianisidine - H2O2, o-phenilen diamin - H2O2) in six different concentrations for the substrate specificity of POD. The substrate specificity of POD was found to be o-phenilen diamin, pyrogallol, o-dianisidine, caffeic acid, ABTS, 4-methylcatechol, catechol and guaiacol, respectively for the plant body. The substrate specificity of POD was found to be o-dianisidine, caffeic acid, pyrogallol, ABTS, o-phenilen diamin, catechol, 4-methylcatechol and guaiacol, respectively for the flower tray. Eight inhibitors were tested in the study and the effectives were found to be sodium azide, thiourea, ascorbic acid, 2-mercapto ethanol, L-Glutatyon and L-Cystein as competitive inhibitors, potassium cyanide, as uncompetitive inhibitor, sodium sulfide as noncompetitive inhibitor. The enzyme activity was also tested against some metals. Fe+3, Zn+2, Mg+2, Hg+2, Ba+2, Ca+2, Li+1, Co+2, Mn+2, Pb+2, Na+1, Ni+2 and Cd+2 ions act as enzyme activator however Cu+2, Sn+2 and K+1 ions act as enzyme inhibitors.Key Words: Peroxidase, Milk thistle, Silybum marianum, antioxidant enzyms, free radicals, antioxidant defence