Kaldirik (trachystemon orientalis) bitkisinden polifenol oksidaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Trachystemon orientalis (Kaldirik) bitkisinden ekstrakte edilen Polifenol oksidaz (PPO) enzimi jel filtrasyon kromatografisiyle kısmi olarak saflaştırılmıştır. Yapılan karakterizasyon çalışmalarında ham enzim ekstraktı kullanılmıştır. Enzim monofenolaz aktivitesi göstermemekle birlikte difenolaz ve trifenolaz aktivitesine sahiptir. Katekol, 4-metil katekol, kafeik asit ve pirogallol substratlarına karşı aktivite gösteren enzimin kafeik asit substratına karşı etkinliği en fazladır. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerlerinin substrata göre farklandığı görülmüştür. Optimum pH değeri katekol ve pirogallol için 7,5; 4-metil katekol için 5,0; kafeik asit için ise 5,5'dur. Optimum sıcaklık değerleri ise katekol için 10C,4-metil katekol için 5°C, kafeik asit için 20C ve pirogallol için 30C'dir. Pekçok PPO enzimi üzerinde şiddetli inhibisyon etkisi yaratan kalay ve kurşun metallerine ve sodyum azid inhibitörüne karşı kaldirik PPO enziminin dayanıklı olduğu tespit edilmiştir. Asidik, bazik ve nötral aminoasitlerle gerçekleştirilen inhibisyon denemelerinde, denenen tüm aminoasitlerin enzimi inhibe ettiği ve en yüksek inhibisyon etkisini asidik aminoasitlerin yarattığı belirlenmiştir. Ayrıca yapılan termal inaktivasyon ve depolanma kararlılığı çalışmaları da enzimin diğer bitki kaynaklı PPO enzimlerine göre daha dayanıklı olduğunu göstermiştir.

In this study, the Polyphenol oxidase enzyme which was extracted from Trachystemon orientalis (Borage) was partially purified by using gel filtration column. The crude extract was used for the characterization studies of the enzyme. Whereas PPO enzyme did not show monophenolase activity, it had diphenolase and triphenolase activity. PPO enzyme that had activity toward catechol, 4-methylcatechol, cafeic acid and pyrogallol has the greatest activity toward cafeic acid. The enzyme showed different optimum pH and temperature values for different substrates. The optimum pH was at 7,5; 5,0; 5,5 for catechol and pyrogallol, 4-methyl catechol, cafeic acid, respectively. The enzyme had an optimum temperature at 10C for catechol, 5C for 4-methyl catechol, 20C for cafeic acid and 30C for pyrogallol. We detected that Trachystemon orientalis PPO was stable against tin and lead metals and sodium azide which could cause heavy inhibition effect on other PPOs. Inhibition assays with acidic, basic and neutral aminoacids showed that all tried aminoacids had inhibitory effect on enzyme and acidic aminoacids were the most effective ones. We also found that Trachystemon orientalis PPO is more stable than other herbal PPOs depending on heat inactivation and storage stability studies.