Eflatun çiçekli ballıbaba (lamium purpureum) bitkisinden polifenol oksidaz enziminin karakterizasyon ve immobilizasyonunun incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada, Lamium purpureum (eflatun çiçekli ballıbaba) bitkisinden elde edilen serbest ve immobilize polifenol oksidaz (PPO) enziminin kinetik özellikleri incelenmiştir. Hem serbest hem de immobilize enzim kullanılarak yapılan karakterizasyon çalışmalarında 4-metil katekol, katekol, pirogallol ve kafeik asit substratları kullanılmıştır. Her bir substrat için Michaelis-Menten sabiti (KM) ve maksimum reaksiyon hızı (Vmax) hesaplanmıştır. Serbest enzim için kafeik asit en yüksek substrat spesifikliğine sahiptir. Serbest enziminin optimum pH değerleri 6,0-8,0; optimum sıcaklık değerleri ise 10-20 °C aralığındadır. PPO enzimi chitin (CHT), chitosan (CTS) ve hidroksiapatite (HAP) immobilize edilmiştir. CHT'e immobilize edilen enzimin kafeik asit substratına karşı ilgisi en fazladır. Optimum pH değerleri 6,0-7,0; optimum sıcaklık değerleri ise 5-50 °C aralığında bulunmuştur. CTS'a immobilize edilen enzim için katekol en yüksek substrat spesifikliğine sahiptir. Optimum pH değerleri 4,0-8,0; optimum sıcaklık değerleri ise 5-40 °C aralığında bulunmuştur. HAP'e immobilize edilen enzimin ise kafeik aside olan ilgisi en fazladır. Optimum pH değerleri 6,0-8,0, optimum sıcaklık değerleri ise 5-50 °C olarak bulunmuştur. Serbest PPO enzimini L-Sistein ile 2-merkapto etanol ve Ca+2, Pb+2, Fe+3 metalleri büyük oranda inhibe etmektedir. Bazı aminoasitlerin serbest enzim üzerine etkisi incelendiğinde L-Lisin'in en yüksek aktivasyona, L-Arginin ve L-Aspartik asidin ise en yüksek inhibisyona sebep olduğu görülmüştür. Serbest PPO enziminin optimum pH'sı 7,5 olarak bulunmuştur. Yapılan PPO depolama kararlılığı sonucuna göre serbest enzim için oda sıcaklığında enzim aktivitesi 12 saat sonunda % 40,7; +4oC' de 120 saat sonunda % 27,91 olarak ölçülmüştür. Her üç materyale immobilize edilen enzimin oda sıcaklığında ve +4 oC' de serbest enzime göre daha uzun süre aktivitesini koruduğu görülmüştür. İmmobilize enzimin yeniden kullanılabilirliği çalışmasında 4.kullanımda CTS % 5,16 değerinde aktivite göstermeye devam ederken, CHT ve HAP için aktivite sıfırlanmıştır.

In this work, it is investigated the kinetic properties of free and immobilized polyphenol oxidase (PPO) obtained from Lamium purpureum (red deadnettle). 4-methylcatechol, catechol, pyrogallol and caffeic acid substrates were used in the characterization studies of free and immobilized enzyme. Michaelis-Menten constant (KM) and maximum reaction velocity (Vmax) were calculated for each substrate. Cafeic acid has the maximum substrate specifity for free enzyme. Free enzyme's optimum pH values were found between 6,0 and 8,0. Optimum temperatures were found as 10 - 20 ℃. PPO enzyme was immobilized on chitin (CHT), chitosan (CTS) and hirdoxiapatite (HAP). Cafeic acid has the maximum substrate specifity for CHT immobilized enzyme. Optimum pH values were found as 6,0-7,0. Optimum temperatures were found between 5 - 50 ℃. For CTS immobilized enzyme catechol has the maximum substrate specifity. Optimum pH values were found between 4,0 and 8,0. Optimum temperatures were found between 5 - 40 ℃. Cafeic acid has the maximum substrate specifity for HAP immobilized enzyme. Optimum pH values were found as 6,0-8,0. Optimum temperatures were found between 5 - 50 ℃. PPO activity substantially was inhibited from L-cysteine, 2-mercaptoethanol, Ca+2, Pb+2, Fe+3 metal ions. When the effect of some amino acids on the PPO was investigated, L-Lysine led to maximum activation, L-Arginine and L-Aspartic acid maximum inhibition. pH tolerance of free PPO was found 7,5. As a result of enzyme storage stability, for free PPO activity at the room temperature after 12 hours % 40,7; at +4 oC after 120 hours % 27,91. Immobilized enzyme has more enzyme endurance at the room temperature and at +4 oC than free enzyme. As a result of enzyme's reusability, in forth use CTS has % 5,16 activity, CHT and HAP were inactive.