Paulownia tomentosa'dan polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve çeşitli bitki özütleri ile inhibisyonu

Abstract

Bu çalışmada, Paulownia tomentosa bitkisinden ekstrakte edilen polifenol oksidaz (PPO) enzimi Üçlü Faz Saflaştırma (ÜFS) yöntemine göre saflaştırılmış olup, PPO için uygun substratlar ve inhibitörlerle karakterize edilerek çeşitli bitki özütlerinin PPO enzimi üzerindeki inhibitör etkileri incelenmiştir. Enzimin substrat spesifikliğini belirlemek için monofenolik, difenolik ve trifenolik yapıdaki substratlardan başlıca pirokatekol, 4-metilkatekol, L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-dopa), L-tirozin, guaikol, pirogallol ve o-dianisidin, pirokatekol, 4-metil katekol, pirogallol ve L-dopa substratları kullanılmıştır. PPO enziminin bu substratlar arasında 4-metil katekol substratına karşı etkinliği Km ve Vmaks değeri 2,17 mM ve 0,002 mM/dk olup optimum pH ve sıcaklık değerleri 7,0 ve 25°C ile en fazladır. Buna karşı enzim monofenollere herhangi bir aktivite göstermemiştir. İnhibitör olarak L-sistein, sodyum azide, L-askorbik asit ve tioüre kullanılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda inhibitörler içerisinde en etkili inhibitör 0,567 mM'lık Ki değeriyle yarışmasız etkili inhibitör olarak L-sisteindir. İnhibitör çalışmalarına ilave olarak Kosova'dan temin edilen Cydonia oblogna, Punica granatum, Rosmarinus officinalis, Verbascum thapsus, Tanacetum vulgare, Momordica charantia, Solanum nigrum ve Datura stramonium bitkileri soxhlet cihazında metanol ile ekstrakte edilerek, bunların PPO enzimi üzerine etkileri 4-metil katekol substratı ile incelenmiştir. Bu bitkiler arasında Tanacetum vulgare ekstraktının 0,2 mg/ml'lık Ki değeriyle karışık inhibisyon şeklinde en etkili inhibitör etkisi gösterdiği tespit edilmiştir.

In this study, the polyphenol oxidase (PPO) enzyme extracted from Paulownia tomentosa plant was purified by the Three-Phase Partitioning (TPP) method and the inhibitory effects on PPO enzyme activity of various plant extracts were investigated by characterizing the enzyme with suitable substrates and inhibitors of PPO. Substrates of monophenolic, difenolic and triphenolic substrates that are specific for the enzyme and substrates such as pyrocatechol, 4-methylcatechol, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), L-tyrosine, guaicolol, pyrogallol and o-dianisidine have been used to determine the specificity of the enzyme. For each of these seven substrates, optimum conditions such as pH and temperature were determined and 4-methylcatechol was found to be one of the most suitable substrates with optimum pH 7,0 and temperature 250C respectively and Km and Vmax values for 4-methylcatechol were 2,17mM and 0,002mM/min. In contrast, the enzyme did not show any activity against monophenols. L-cysteine, sodium azide, L-ascorbic acid and thiourea were used as the inhibitors. The most effective was found to be L-cysteine which acted as a Non-competitive inhibitor with a Ki value of 0,567mM. In addition to the studies on inhibitors, the medical plants Verbascum thapsus, Tanacetum vulgare, Momordica charantia, Solanum nigrum and Datura stramonium harvested from Kosovo were extracted with methanol in a soxhlet apparatus and the effects of these extracts on the PPO enzyme were examined by 4-methyl catechol as a substrat. Among the plant extracts, the Tanacetum vulgare was found to be the most effective inhibitor in the form of mixed inhibition with Ki of 0.2 mg /ml.