Biotransformation of pregnenolone by penicillium olsonii = Pregnenolonun penicillium olsonii ile biyotransformasyonu

Abstract

Tüm canlılar yaşamları boyunca doğal substratları olmayan çeşitli kimyasal maddelerle karşılaşırlar ve bunlar ksenobiyotik olarak adlandırılır. Enzimlerin veya enzim içeren biyolojik sistemlerin ksenobiyotikler üzerinde meydana getirdiği kimyasal değişikliklere biyotransformasyon denir. Enzimler canlı organizmalardaki hemen hemen tüm reaksiyonları aktivasyon enerjisini (EA) düşürerek gerçekleştirirler. Enzimler reaksiyon dengesine ulaşma süresini azaltmalarına rağmen, reaksiyon tarafından tüketilmezler. Enzimler çok etkili katalizörler olduklarından ve kullanıcıları için bazı avantajlar sağladıklarından, örneğin, enzimatik bir reaksiyon için reaksiyon hızı 108-1010 kat hızlanır ve bu 1012 değerini bile aşabilir. Enzimler amino asitlerden yapıldıkları ve tamamen parçalanabildikleri için çevresel olarak kabul edilebilirdir. Diğer kimyasal reaktiflerin çoğu çevresel sorunlara neden olsa da, enzimler genellikle ılımlı koşullar altında (yaklaşık pH 7, 30 °C ve 1 atm) hareket eder ve bu da izomerizasyon, rasemizasyon, yeniden düzenlemeler, ayrışma gibi bazı sorunları en aza indirir. Enzimler birbirleriyle uyumlu olduklarından, enzimler genellikle aynı veya benzer koşullar altında çalışırlar. Bu nedenle, çok enzimli sistemler kullanılarak bir ortamda birden fazla reaksiyon gerçekleştirilebilir. Bazı enzimler sadece belli bileşikler ile etkileşirken bazı enzimler yüksek substrat teloransı gösterirler ve çok çeşitli doğal veya doğal olmayan bileşikler ile etkileşebilir. Enzimler geniş bir reaksiyon spektrumu gösterir ve neredeyse bilinen her reaksiyona eşdeğer bir enzimatik reaksiyon vardır. Enzimler kemoselektif, regioselektif ve enantioselektif moleküllerdir. Enzimler kemoselektif oldukları için genellikle sadece tek bir tür fonksiyonel grup üzerinde etkili olduklarından ve diğer fonksiyonlar değişmeden kaldığından, enzimatik reaksiyonlar genellikle daha temiz olma eğilimindedir. Enzimler regioselektif olduklarından, aynı substrat molekülünün farklı bölgelerinde kimyasal olarak bulunan fonksiyonel gruplar arasında ayrım yapabilirler. Enzimler, karmaşık üç boyutlu yapıları nedeniyle bu avantajlara sahip olabilirler. Enzimler enantiyoselektif oldukları ve sadece L- amino asitlerden oluştukları için kiral katalizörlerdir. Bu nedenle, substrat molekülü üzerindeki her türlü kiralite enzimler tarafından algılanır. Enzimin etkisi ile prokiral bir substrat, kiral bir ürüne dönüşebilir ve rasemik bir substrattaki her iki enantiyomer ile genellikle farklı oranlarda reaksiyona girerek kinetik bir resulosyona neden olabilir. Biyotransformasyonlar genellikle ya izole enzim sistemleri ya da mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilir. Ticari olarak mevcut 300'den fazla izole enzim sistemi olduğu düşünülmektedir. İlgili birçok enzim sistemi membrana bağlı olduğundan ve izole edilmesi zor olduğundan, biyotransformasyonlar için genellikle mikroorganizmalar kullanılır. Biyotransformasyonlar için genellikle kullanılan yaygın mikroorganizma grupları küfler, mayalar, bakteriler ve mikroalglerdir.Mikroorganizmalarla gerçekleştirilen biyotransformasyonlar mikrobiyal biyotransformasyonlar olarak adlandırılır. Mikrobiyal biyotransformasyonlar, çevre dostu olmaları, daha hızlı, daha ucuz olmaları ve erlenden fabrika fermentörüne kadar çeşitli ortamlarda gerçekleştirilebilmeleri gibi önemli avantajları nedeniyle biyotransformasyonlar için çoğunlukla mikroorganizmalar kullanılmaktadır. Mikrobiyal biyotransformasyonlar için mikroorganizmalar serbest olarak veya uygun yüzeylere immobilize edilerek kullanılabilmektedir. Mikrobiyal biyotransformasyonlar çoğunlukla küfler, mikrobiyal algler, mayalar ve bakteriler ile uygulanmaktadır. Küfler ve bakteriler gibi mikroorganizmalar, spesifik olmayan enzimlerini kullanarak birçok doğal veya sentetik substratta çok farklı kimyasal değişiklikler üretebilirler. Mikrobiyal biyotransformasyonlar sitokrom P-450 enzimleri tarafından gerçekleştirilir ve en önemli mikrobiyal biyotransformasyonlardan biri mikrobiyal hidroksilasyondur. Mikrobiyal hidroksilasyon reaksiyonu ilk olarak 1952 yılında gözlemlenmiştir. Bazı kortikosterodların ilaç olarak sentezi sırasında, klasik kimyasal yöntemlerle fonksiyonel gruplardan uzak bir konuma oksijen fonksiyonu yerleştirmek çok uzun ve pahalı bir süreçti. Bu sorunun Rhizopus arrhizus küfü aracılığıyla söz konusu pozisyonda bir hidroksilasyonla ortadan kaldırılması, tüm dikkatleri mikrobiyal biyotransformasyonlara yöneltti. Bu keşif ve mikrobiyal hidroksilasyonun öneminin anlaşılmasının ardından, birçok farklı mikroorganizma ile birçok farklı kimyasal türünün biyotransformasyonları gerçekleştirilmiştir. Tüm canlılarda bulunan, büyüme ve gelişmelerinde doğrudan rol almayan organik bileşiklere ikincil metabolitler veya doğal ürünler denir. Bu kimyasallar genellikle içinde bulundukları organizmalar için daha iyi yaşam koşulları sağlar. Doğal ürünler, özellikle diğer canlılar üzerindeki etkileri nedeniyle çok dikkat çeken bileşiklerdir. Doğal ürünler tüm canlılarda bulunmasına rağmen, daha çok bitkiler, mikroorganizmalar, mantarlar ve böceklerde gözlenir. Doğal ürünler çok sayıda ve çok farklı yapıda olmalarına rağmen, biyosentezlerindeki bazı ortak benzerlikler nedeniyle genellikle terpenler, alkaloidler, steroidler, fenolik bileşikler, özelleşmiş karbonhidratlar, özelleşmiş peptitler, poliketitler, yağ asitleri ve yağ asidi türevleri olarak gruplandırılırlar. Steroidler doğal ürünlerin en önemli gruplarından biridir. C-3'de bir hidroksil grubu ile D halkasındai farklı uzunluklara ve yapılara sahip alifatik yan zincirleri içeren steroidler steroller olarak adlandırılır. Mantarlardaki ergosterol, bitkilerdeki stigmasterol, hayvanlar ve insanlardaki kolesterol en yaygın ve en iyi bilinen sterollerdir. Kolesterol hayvan ve insan membranlarının akışkanlığını düzenleyen önemli bir moleküldür. Kolesterol biyosentezi oldukça karmaşıktır ve 3 aşamada öetlenebilir. İlk aşamada önce 3 asetil koenzim A bileşiğinden once mevalonat sentezlenir ve daha sonra izoentenil difosfat olarak da bilinen izopentenil pirofosfata dönüştürülür. İkinci aşamada izopentenil pirofosfat bileşiği önce dimetilalil pirofosfata izomerize edilir. Dimetilallil pirofosfatın bir izopentenil pirofosfat ile kondensasyonu sonucunda bir geranil pirofosfat oluşur. Geranil pirofosfatın başka bir izopentenil pirofosfat ile kondenzasyonu farnesil pirofosfat oluşumu ile sonuçlanır. İki adet farnesil pirofosfatın bir indirgeme reaksiyonunda kondenzasyonu sonucunda bir triterpen ve diğer triterpenlerin başlangıç maddesi olan skualen oluşur. Son adımda, skualenin epoksidasyonu ile skualen epoksit oluşur ve bu bileşiğin daha sonra halkalaşması ilk halkalı bileşik olarak lanosterol oluşumuna yol açar. Lanosterol ise daha sonar 19 reaksiyon üzerinden kolesterol bileşiğine dönüştürülür.Kolesterol aynı zamanda safra asitleri, D3 vitamini ve steroid hormonlar gibi bazı çok önemli bileşiklerin başlangıç maddesidir. Kolesterol, yan zinciri kısaltılarak pregnenolon üzerinden diğer steroid hormonların başlangıç maddesi olan progesterone dönüştürülür. Pregnenolon, progesteron için başlangıç materyali olan önemli bir steroitdir. Steroid hormonlar; glukokortikoidler, mineralokortikoidler, progestajenler (progestinler), östrojenler ve androjenler olmak üzere 5 gruba ayrılır. Glukokortikoidler ve mineralokortikoidler kortikosteroidler olarak bilinirken, androjenler ve östrojenler ve progestajenler cinsiyet hormonları olarak bilinir. Eşey hormonlarının temel işlevleri üreme organlarının büyümesini ve gelişmesini, ikincil eşey özellikleri ve üreme döngüsünü düzenlemektir. Bazı eşey hormonlarının güçlü anabolik etkileri de vardır; kemik, kas ve deri gibi birçok dokunun gelişimini teşvik eder ve metabolizmayı korurlar. Progestagenlerin en yaygın ve aktif temsilcisi olan progesteron, doğal bir steroid hormondur ve aynı zamanda memelilerde diğer steroid hormonların sentezlendiği bir ara bileşiktir. Androjenler erkek omurgalılarda, östrojenler ise dişi omurgalılarda aktif olan eşey hormonlarıdır. Östrojenler ise androjenlerden sentezlenir. Bu çalışmada pregnenolon Penicillium olsonii MRC 500780 ile 5 gün boyunca inkübe edildi. Bir litre besiyeri hazırlandı ve 250 mL'lik 10 erlene eşit olarak dağıtıldı. Erlenlerdeki besiyeri daha sonra otoklavda sterilize edildikten sonra bu erlenlere P. olsonii inoküle edildi. Erlenler 28 ºC'de 3 gün boyunca çalkalayıcıda inkübe edildikten sonar DMF içindeki substrat aseptik olarak erlenlere eklendi. Tüm erlenler 5 gün daha inkübe edildikten sonar küf miselleri vakum altında gerçekleştirilen filtrasyon ile besiyerinden ayrıldı. Miseller etil asetat ile yıkandıktan sonar filtrat etil asetat ile ekstrakte edildi. Ekstraktlar susuz sodyum sülfat ile kurutulup evaporasyon ile uçurulduğunda yağımsı kahverengi bir madde elde edildi. Bu yağımsı madde daha sonra silika jel 60 üzerinde kolon kromatografisine maruz bırakıldı. Kromatografi çalışmasından progesteron ve 15α-hidroksipregn-4-en-3,20- dion metabolitleri elde edidi. Bu metabolitlerin yapıları substrata ait erime noktası, NMR ve IR spektrumlarının metabolitlere ait erime noktaları, NMR ve IR spektrumlarının karşılaştırılması ile belirlendi.

Natural products that are not directly involved in the growth and development of living organisms often provide better living conditions for the organisms in which they are found. These compounds are particularly highly regarded because of their effects on other living organisms. Although natural products have many different structures, they are generally grouped as terpenes, alkaloids, steroids, phenolic compounds, specialized carbohydrates, specialized peptides, polyketides, fatty acids and fatty acid derivatives due to some common structural characters in their biosynthesis. Steroids are one of the most important groups of natural products. Cholesterol is a very important steroid that regulates the fluidity of membranes in animals and humans. Cholesterol is the starting material for some important compounds such as steroid hormones, bile acids and vitamin D3. Steroid hormones are classified into 5 groups: progestagens (progestins), estrogens, androgens, glucocorticoids and mineralocorticoids. Cholesterol is converted into progesterone, which is the starting material for other steroid hormones, over pregnenolone by shortening its side chain through several reactions. Pregnenolone is a important steroid, which is the starting material for progesterone. Biotransformations are the chemical changes that occur on xenobiotics by biological systems such as microorganisms, microorganism spores, microsomes and cell, tissue and organ cultures containing enzymes or enzymes. Microbial biotransformations with microorganisms are mostly applied with microorganism groups such as molds, microbial algae, yeasts and bacteria. Today, the production of many important chemicals, such as hormones and drugs, is usually carried out by microbial biotransformations instead of classical synthesis methods. In this work, biotransformation of pregnenolone was carried out with Penicillium olsonii MRC 500780. The medium for Penicillium olsonii MRC 500780 was distributed in flasks and sterilized in autoclave. After the mold was inoculated into these flasks under sterile conditions, the flasks were left to incubation for 3 days. Then pregnenolone was added under sterile conditions and incubated for another 5 days. After incubation, steroids in the filtered medium were extracted with ethyl acetate. The steroids in the residue obtained by evaporation of the extracts were separated by column chromatography. Incubation of the substrate with Penicillium olsonii MRC 500780 afforded progesterone and 15α-hydroxypregn-4-ene-3,20-dione. The structure determinations of the metabolites were carried out by comparing the melting points, NMR and IR spectra of the substrate with those of metabolites and the subsrate.