Synthesis of (-)-Camphene derivatives and evaluation of their biological activities = (-)-Kamfen türevlerinin sentezi ve biyolojik aktivitelerinin değerlendirilmesi

Abstract

Terpenler, koku ve tatlarını veren aromatik yağlardır. Bu bileşiklerin ayrıca çeşitli tıbbi faydalar sağladığı da kabul edilmiştir. (±)-Kamfen, çam terpeni olarak bilinen bir cannabis terpeninin güçlü bir misk ve toprak kokusuna sahip bir örneğidir. Kamfen C10H16 kimyasal formülüne sahiptir ve molekül ağırlığı 136,24 g/mol'dür. Kamfen, D-kamfen ve L-kamfen olarak da bulunur. Kamfen katı bir görünüme sahiptir ancak erime noktası 50°C'dir. (±)-Kamfen suda çözünmezken sikloheksan, alkol ve kloroform içeren doğal çözücülerde kolaylıkla çözünür. Toksafen ve kafurun her ikisine de kamfen denir. İzobornil asetat gibi tatlandırıcılar ve aromatikler ve diğer kimyasalları oluşturan organik bileşikler ara madde olarak işlev görür. 1800'lü yıllarda yakıt olarak gaz yağı yerine kamfen kullanılmıştır. (±)-Kamfen birçok parfüm, yağ ve topikal losyonun ana bileşenidir. Ayrıca kozalaklı ağaçlarda, hindistan cevizi, zencefil ve biberiye gibi bitkilerde doğal olarak bulunur. (±)-Kamfen için yaygın bir sentetik yöntem, başka bir kenevir terpeni olan pinen kullanmaktır. (±)-Kamfen, kenevir bazlı bazı merhemlerde, kremlerde ve losyonlarda yaygın olarak kullanılır ve kamfenin antifungal ve antibakteriyel etkinliği sayesinde egzama ve sedef hastalığı gibi cilt hastalıklarını tedavi etme yeteneğine sahip olduğunu gösterir. Terpenler birçok bitki ve hayvanda bulunan geniş ve çeşitli bir organik bileşik sınıfıdır. Terpenler karakteristik aroma ve tatlarıyla bilinirler ve aynı zamanda çeşitli biyolojik işlevlere sahiptirler. Terpenler birçok reaksiyon için uygun yapıya sahip bileşiklerdir. Terpenler, organik sentez kimyasında önemli rolü olan oksidasyon, izomerizasyon, polimerizasyon, hidrojenasyon ve indirgenme reaksiyonlarını verirler. Ayrıca kamfen gibi bisiklik monoterpenlerde Wagner-Meervein yeniden düzenlemesi gerçekleşebilir. Bisiklik monoterpenlerin düzenlenmesi yıllardır ilgi odağı olmuştur ve hala bisiklik monoterpenlerde iyonik katılma reaksiyonları Wagner-Meerwein yeniden düzenlenmesi nedeniyle meydana gelmektedir. Bisiklik monoterpenlerdeki Wagner-Meerwein yeniden düzenlemesi, metil grubu gibi bir sübstitüentin çift bağ üzerindeki bir karbon atomundan tek bağ üzerindeki bitişik bir karbon atomuna geçişini içerir. Bu sürece genellikle rezonans veya komşu gruplar tarafından stabilize edilebilen bir karbokatyon ara ürününün oluşumu eşlik eder. Wagner-Meerwein kuralları, karbokatyon ara maddesinin stabilitesine dayalı olarak yeniden düzenlemenin sonucunu tahmin eder. Bu çalışmanın en özgün yanı bisiklik yapıya sahip kamfenin brominasyonu ve bu brominasyon esnasında düzenlenmenin durdurulmasıdır. Bisiklik yapıdaki rijit alkenlerin bromlanma reaksiyonları klasik alkenlerin bromlanma reaksiyonlarından oldukça farklıdır. Normal şartlar altında brominasyon reaksiyonları bromonyum iyonu üzerinden yürürken, bu tür moleküllerin brominasyonunda çoğunlukla bromonyum iyonu non-klasik karbokatyona göre düzenlenir. Bu sebeple brominasyon non-klasik karbokatyon üzerinden ilerler. Klasik ve non-klasik karbokatyon arasındaki en temel fark, klasik karbokatyonların üç kimyasal bağda altı elektrona sahip bir karbon atomuna sahip olması,non-klasik karbokatyonların ise üç merkezli, iki elektronlu yapısının olmasıdır. İyon geçişi, bisikloheptan iskelet yapısına sahip olan klasik ve non-klasik karbokatyonların (±)-kamfen hidroklorürün izobornil klorüre yeniden düzenlenmesi sırasında oluşur. Bu çalışmalardan sonra devam eden araştırmalarda Meervein kimyasal reaksiyonlardaki bu tür ürünleri karbonyum olarak tanımlamıştır. Farklı bir araştırmada 2-norbornil tosilatın solvolizi sırasında oluşan ara ürünler non-klasik karbokatyonlar olarak tanımlanmıştır. Kenetlenme reaksiyonları organik kimyanın vazgeçilmez ve temel reaksiyonlarından biridir. Çalışmalarımızın büyük bir kısmını brominasyon reaksiyonları yanında Suzuki-Miyaura çapraz kenetlenme reaksiyonları oluşturmaktadır. Organik kimyada karbon-karbon bağlarının oluşumu için genellikle Suzuki-Miyaura çapraz kenetlenme reaksiyonları ile gerçekleştirilebilir. Organoboronik asit ile halojenürler veya triflat arasında Suzuki-Miyaura çapraz kenetlenme reaksiyonları için bir paladyum katalizörünün kullanılması gerekir. Pd ve Ni gibi geçiş metalleri tipik olarak katalizör olarak kullanılır. "Pd(0)-Pd(II) katalitik çevrimi"ni kullanan bu geleneksel reaksiyonun mekanizması, oksidatif katılma, transmetalasyon ve redüktif eliminasyon adımlarından oluşmaktadır. Hem çevre dostu hem de basit olan Suzuki-Miyaura çapraz kenetlenme reaksiyonları poliolefinleri, stirenleri ve sübstitüe edilmiş bifenilleri sentezlemek için kapsamlı bir şekilde araştırılmış ve sıklıkla uygulanmıştır. (±)-Kamfen monosikloterpenlerin bir çeşididir. Kamfen genellikle tıbbi potansiyele sahip indika türlerinde daha yaygın olarak bulunur ve dikkate değerdir. Bu çalışmada (-)-kamfen (70), yeni biyolojik olarak aktif bileşiklerin (73-77) sentezi için anahtar bileşikler olarak kullanılacaktır. (-)-Kamfenden [%75 (%90 fenchenli kamfen)] başlayarak brominasyon reaksiyonları ve Suzuki-Miyaura kenetlenme reaksiyonları gerçekleştirilecektir. Bu brominasyon sisteminde, (-)-kamfen (70), diklorometan (20 mL) içinde çözülerek, Br2 (CH2Cl2 içinde çözünmüş), bir basınç dengeli damlatma hunisi yardımıyla reaksiyon karışımına damla damla eklenecektir. Dibromo-(-)-kamfene (71) anilin eklenip reaksiyon karışımı 2 saat boyunca geri soğutucu altında kaynatıldığında (1S,4R)-3-(Bromometilen)-2,2-dimetilbisiklo[2.2.1]heptan (72) elde edilecektir. Metal katalizli reaksiyonlar için uygun bromlu türevler birçok yeni ürün için önemli bir anahtar bileşiktir. Bu çalışmada metal katalizli Suzuki-Miyaura kenetlenme reaksiyonları, monobromo-(-)-kamfenden yeni (-)-kamfen türevlerinin sentezi için uygulanması planlanmaktadır. Bisiklik yapıların kenetlenme reaksiyonları Pd(PPh3)4 gibi katalizörler varlığında ve çeşitli boronik asitler (fenil, 4-metoksifenil, 4-tiyometilfenil, 4-etilfenil, 4-triflorometoksifenil) ile gerçekleştirilmiştir. İlgili bileşikler sentezi için genel sentez prosedürü izlenerek monobromo-(-)-kamfen (72) ve ilgili boronik asit bileşikler (73-77) ile etkileştirilmiş, ardından reaksiyon karışımına baz olarak K2CO3, çözücü olarak toluen etanol ve su (1:1:1) eklenip 110°C'de 17 saat boyunca geri soğutucu altında kaynatılmıştır. Daha sonra ham ürün etilasetat (3x50 mL) ile ekstrakte edildi ve organik faz Na2S04 ile kurutuldu ve reaksiyon karışımı silikajel kolon kromatografisiyle saflaştırıldı. Nihai bileşikler, 1H NMR, 13C NMR ve FTIR spektroskopi yöntemleri kullanılarak karakterize edildi; ayrıca fotoaktif ve negatif polarimetrik oldukları da gösterildi. (-)-Kamfen türevlerinin biyolojik etkileri (kanser hücre hatları ve hücre kültürü, sitotoksisite testi, agaroz jel elektroforezi ile DNA fragmentasyonu, migrasyon deneyi, mikrodilüsyon deneyi ile antibakteriyel ve antifungal aktivite ölçümü) incelendi. (-)-Kamfen türevlerinin biyolojik etkileri (kanser hücre hatları ve hücre kültürü, sitotoksisite testi, agaroz jel elektroforezi ile DNA fragmentasyonu, migrasyon deneyi, mikrodilüsyon deneyi ile antibakteriyel ve antifungal aktivite ölçümü) incelendi. Bu çalışmada A549 (ATCC, CCL-185), Calu1 (ATCC, HTB-54) ve H1650 (ATCC, CRL-5883) akciğer kanseri hücre hatları, SW1353 (ATCC, HTB-94)/MG63 (ATCC, CRL-1427)/ ve Saos2 (ATCC, HTB-85) kemik kanseri hücre hatları], Beas2B (RRID, CVCL-0168) normal akciğer hücre hatları ve HC (Sigma Aldrich, 402-05A) normal kondrosit hücre hatları kullanıldı. Sentezlenen bileşiklerin (71-77) hücre çoğalması ve NCI-60 hayatta kalma parametresi değerleri üzerindeki etkilerini ölçmek için MTT testi kullanıldı. Test edilecek bileşiklerin (71-77) hücre sitotoksik mi yoksa sitostatik mi olduğu LDH yöntemiyle belirlendi. (-)-kamfen bileşiklerinin DNA merdivenleme aktivitesi, standart yönteme uygun olarak bir DNA merdivenleme tahlili ile değerlendirildi. Bileşiklerin hücrelerin göçü üzerindeki etkisini belirlemek için yara iyileşme denemeleri kullanıldı. Test maddesini içeren ortamdaki hücrelerin çoğalma yeteneğinin ölçülmesine dayanan bir yöntemdir. Bu projede mikrodilüsyon testi kullanılarak antibakteriyel ve antifungal aktivitelerin ölçülmesi için [E. faecalis VRE ATCC 19433, E. faecalis ATCC 29212, S. aureus MSSA ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus MRSA ATCC 46300, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa AGME ATCC 27853, C. albicans (ATCC 10231), S. gordonii (NCTC 7870) ve A. actinomycetemcomitans (ATCC 33384)] kullanıldı. Bu nedenle bu moleküller tüm bakteri ve mantarlara karşı antimikrobiyal özelliklere sahip değildir ancak (-)-kamfen molekülleri bu özelliklere sahiptirler, antikanser aktivitelerinden kısmen sorumludurlar, kanser tedavisi için iyi bir seçenek olabilir ve bileşik 72 kemik kanseri için daha özgüdür ve akciğer kanseri türlerini daha ileri klinik öncesi çalışmalar için en uygun hale getirmektedir.

Terpenes are aromatic oils that give their fragrance and taste. These compounds have additionally been acknowledged to hold an array of medicinal advantages, (±)-camphene is a one of example cannabis terpene possessing a strong musky and earthy smell with hints of pine. (±)-Camphene is a primary ingredient in many perfumes, oils, and topical lotions. It is also naturally present in conifers, nutmeg, ginger, and rosemary. A common synthetic method for (±)-camphene is to use pinene, another cannabis terpene. (±)-Camphene is commonly used in some of salves, creams and lotions that are cannabis-based and its possibility of this ability to treat skin conditions such as eczema and psoriasis indicates camphene could hold antifungal and antibacterial effectiveness. Camphene is generally more commonly found in indica strains with medicinal potential and is notable. In this study, (-)-camphene (70) will be used as key compounds for the synthesis of new biologically active compounds (73-77). Starting from (-)-camphene [75% (camphene with 90% fenchene)], bromination reactions and Suzuki-Miyaura coupling reactions will be carried out. In this bromination system, (-)-camphene (70) will be dissolved in dichloromethane (20 mL), and Br2 (dissolved in CH2Cl2) will be added dropwise to the reaction mixture with the help of a pressure balanced dropping funnel. When aniline is added to dibromo-(-)-camphene (71) and the reaction mixture is boiled under reflux for 2 hours, (1S,4R)-3-(Bromomethylene)-2,2-dimethylbicyclo-2,2-dimetilbisiklo[2.2.1]heptane (72) will be obtained. Brominated derivatives suitable for metal-catalyzed reactions are an important key compound for many new products. In this study, it is planned to apply metal-catalyzed Suzuki-Miyaura coupling reactions for the synthesis of new (-)-camphene derivatives from monobromo-(-)-camphene. Coupling reactions of bicyclic structures were carried out in the presence of catalysts such as Pd(PPh3)4 and various boronic acids (phenyl, 4-methoxyphenyl, 4-thiomethylphenyl, 4-ethylphenyl, 4-trifluoromethoxyphenyl). Following the general synthesis procedure for the synthesis of relevant compounds, monobromo-(-)-camphene (72) and related boronic acid compounds (73-77) were interacted with, then K2CO3 was added to the reaction mixture as a base, toluene ethanol and water as solvents (1:1:1) was added and boiled under reflux at 110°C for 17 hours. Then, the crude product was extracted with ethylacetate (3x50 mL) and the organic phase was dried with Na2SO4 and the reaction mixture was purified by silica gel column chromatography. The final compounds were characterized using 1H NMR, 13C NMR and FTIR spectroscopy methods; they were also shown to be photoactive and negatively polarimetric. The biological effects of (-)-camphene derivatives (cancer cell lines and cell culture, cytotoxicity test, DNA fragmentation by agarose gel electrophoresis, migration assay, antibacterial and antifungal activity measurement by microdilution assay) were examined. In this study, A549 (ATCC, CCL-185), Calu1 (ATCC, HTB-54), and H1650 (ATCC, CRL-5883) lung cancer cell lines, SW1353 (ATCC, HTB-94)/MG63 (ATCC, CRL-1427)/, and Saos2 (ATCC, HTB-85) bone cancer cell lines], Beas2B (RRID, CVCL-0168) normal lung cell line, and HC (Sigma Aldrich, 402-05A) normal chondrocytes cell line were used. MTT test was used to measure the effects of the synthesized compounds (71-77) on cell proliferation and NCI-60 survival parameter values. It was determined by the LDH method whether the compounds to be tested (71-77) were cell cytotoxic or cytostatic. DNA laddering activity of the (-)-camphene compounds was evaluated by a DNA laddering assay in accordance with the standard method. Wound healing assay was used to determine the effect of the compounds on the migration of cells. It is a method based on measuring the proliferation ability of cells in the medium containing the test substance. For measuring the antibacterial and antifungal activities using microdilution test in this project [E. faecalis VRE ATCC 19433, E. faecalis ATCC 29212, S. aureus MSSA ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus MRSA ATCC 46300, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa AGME ATCC 27853, C. albicans (ATCC 10231), S. gordonii (NCTC 7870) and A. actinomycetemcomitans (ATCC 33384)] were used. Therefore, these molecules lack antimicrobial properties against all bacteria and fungi but they have the effect of (-)-camphene molecules are partly responsible for their anticancer activities it may be a good option for cancer treatment and compound 72 was more cancer-specific for bone and lung cancer types, and make it is the most convenient one for further preclinical studies.