Biotransformation of dehydroepiandrosterone by Penicillium olsonii = Dehidroepiandrosteronun Penicillium olsonii ı̇le bı̇yotransformasyonu

Abstract

Doğal ürünler, canlı organizmaların büyümesi ve çoğalması için gerekli olmayan maddelerdir. Diğer canlılar üzerindeki etkileri nedeniyle doğal ürünler canlılara fayda sağlamakta ve daha fazla ilgi çekmektedir. Terpenoidler, alkaloidler, steroidler, poliketidler, peptidler, fenilpropanoidler, özel amino asitler, özel karbonhidratlar ve yağ asitleri ve türevleri gibi gruplar doğal bileşikleri kategorize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Biyotransformasyonlar, biyolojik sistemlerin ksenobiyotik maddeler üzerinde gerçekleştirebildiği kimyasal değişikliklerdir. Biyotransformasyonlar enzim içeren biyolojik sistemler ve serbest veya immobilize enzimler tarafından gerçekleştirilir. Biyotransformasyonlar için standart biyolojik sistemler olarak genellikle hücre kültürleri, doku kültürleri, organ kültürleri, mikrozomlar, mikroorganizmalar ve mikrop sporları kullanılır. Canlılarda, enzimler aktivasyon enerjisini (EA) azaltarak neredeyse her reaksiyonu gerçekleştirir. Enzimler reaksiyonun dengeye ulaşması için gereken süreyi kısaltır, ancak süreç tarafından tüketilmez veya değiştirilmezler, reaksiyonun DG'sini veya denge konumunu da değiştirmezler. Uluslararası Biyokimya Birliği tarafından 3200'den fazla enzim kaydedilmiştir ve doğada 25.000 enzim olabileceği tahmin edilmektedir. Oldukça etkili katalizörler oldukları için, enzimlerin kullanıcıları için belirli faydaları vardır. Örneğin, enzimatik reaksiyonların reaksiyon hızlarını 108-1010 kat artırılabilir ve nadir durumlarda bu 1012'yi bile geçebilir. Enzimler tamamen biyolojik olarak parçalanabilir olduklarından ve amino asitlerden oluştuklarından, çevre için kabul edilebilirdirler. Diğer kimyasal reaktiflerin çoğu çevre üzerinde olumsuz bir etkiye sahipken, enzimler genellikle ılımlı ortamlarda (pH 7, 30 °C ve 1 atm) çalışır. Sonuç olarak izomerizasyon, rasemizasyon, yeniden düzenlemeler ve parçalanma gibi belirli sorunlar azalır. Enzimler birbirleriyle uyumlu olduklarından, tipik olarak aynı veya benzer ortamlarda çalışırlar. Sonuç olarak, multienim sistemleri kullanılarak tek bir şişede birçok reaksiyon gerçekleştirilebilir. Çoğu enzim yüksek bir substrat toleransına sahipken, bazı enzimler amaçlanan işlevleriyle sınırlı değildir. Bu enzimler hem doğal hem de yapay çok çeşitli maddeleri kabul edebilmektedir. Enzimlerin katalizleyebileceği birçok farklı reaksiyon türü vardır ve pratik olarak bilinen herhangi bir reaksiyon bir enzim tarafından katalize edilebilir. Enzimler kemoseçicilik, rejioseçicilik ve enantioseçicilik özelliklerine sahip moleküllerdir. Kemoseçici olduklarından, genellikle sadece belirli bir tür fonksiyonel grubu etkilerken diğer fonksiyonları değiştirmeden bırakırlar. Dolayısıyla enzimatik reaksiyonlar tipik olarak daha temiz bir kaliteye sahiptir. Rejiyoseçicilikleri sayesinde enzimler, aynı substrat molekülü içinde farklı kimyasal konumlarda bulunan fonksiyonel gruplar arasında ayrım yapabilmektedir. Enzimlerin karmaşık üç boyutlu mimarisi bunu başarmalarını sağlayabilir. L-amino asitlerden türetilen kiral katalizörler oldukları için enzimler enantiyoselektiftir. Dolayısıyla enzimler bir substrat molekülü üzerindeki her türlü kiraliteyi tanıyabilir. Rasemik bir substrattaki her iki enantiyomer tipik olarak farklı oranlarda reaksiyona girerek kinetik bir reaksiyona neden olabilir ve prokiral bir substrat kiral bir ürüne dönüştürülebilir. Bununla birlikte, enzim kullanmanın dezavantajları da vardır. Doğada bulunan bir tür enantiyomer bir enzimdir. Diğer tür enantiyomerik ürüne ihtiyaç duyulduğunda tam tersi stereokimyasal seçiciliğe sahip bir enzim gereklidir. Ancak bu çoğu zaman mümkün değildir. Enzimler özel çalışma koşulları gerektirir. Yüksek sıcaklıklar ve asidik pH bazı enzimleri engelleyebileceğinden, ılıman ortamlarda çalışmak zaman zaman sorunlu olabilir. Su, yüksek kaynama noktası ve yüksek buharlaşma ısısı nedeniyle enzimlerin bu çözücüde maksimum katalitik aktivitelerini sergilemelerine rağmen organik proseslerin çoğu için en az ideal çözücüdür. Buna ek olarak, organik moleküllerin çoğu sulu çözeltilerde zorlukla çözünür. Bu nedenle, enzimatik bir prosesin sulu bir ortamdan organik bir ortama geçirilmesi oldukça arzu edilen bir durumdur. Ancak, enzim denatürasyonu nedeniyle, bu durum katalitik aktivitede bir azalmaya neden olabilir. Enzimlerin dayandığı doğal kofaktörler son derece önemlidir. Enzimler, doğal olmayan substratları kabul etmedeki olağanüstü esnekliklerine rağmen, neredeyse tamamen NADH ve NADPH gibi doğal kofaktörlerine gereksinim duyarlar. Ne yazık ki, bu moleküller nispeten kararsız olduklarından, stokiyometrik seviyelerde kullanılamayacak kadar maliyetli olduklarından ve her ikisi de mümkün olmadığından, daha uygun fiyatlı sentetik muadilleriyle ikame edilemezler. Enzimler inhibisyon olaylarına karşı hassastır. Enzimlerin daha yüksek substrat ve/veya ürün konsantrasyonlarında çalışmayı durdurmasına neden olan madde veya ürün inhibisyonu, birçok enzimatik işlemi etkileyebilir. Ayrıca, bazı enzimler alerjik reaksiyonları tetikleyebilir, ancak bu risk onlara kimyasallar gibi davranarak ve kullanırken dikkatli olarak azaltılabilir. Tipik olarak, biyotransformasyonlar bütün, bozulmamış mikroorganizmalar veya izole enzim sistemleri tarafından gerçekleştirilir. Yaklaşık 300 izole enzim sisteminin satışa sunulduğu tahmin edilmektedir. Gerekli enzim sistemlerinin çoğu membrana bağlı olduğundan ve ekstrakte edilmesi zor olduğundan, biyotransformasyonlar bütün hücre sistemleri olan mikroorganizmalar ile gerçekleştirirlir. Biyotransformasyonlar için kullanılan dört ana mikroorganizma türü; bakteriler, mayalar, küfler ve mikroalglerdir. Mikroorganizmalar, spesifik olmayan enzim sistemleri aracılığıyla hem doğal hem de insan yapımı substratlar üzerinde çeşitli reaksiyonlar gerçekleştirir. Bu süreçler arasında mikrobiyal hidroksilasyonlar en yaygın ve tercih edilenidir. Mikrobiyal hidroksilasyon 1952 yılında kortikal steroidlerin sentezi ile ilgili önemli bir sorunun çözümüne yardımcı olduğunda, bu sürecin önemi ilk olarak fark edilmiştir. Pozisyonun diğer fonksiyonel gruplardan izole olması nedeniyle, C-11'e bir oksijen fonksiyonunun eklenmesi son derece zaman alıcı, pahalı ve zorlu bir prosedürdü. Rhizopus arrhizus bu sorunu mikrobiyal hidroksilasyon ile etkili bir şekilde çözdü. Bu mikrobiyal hidroksilasyondan sonra mikrobiyal biyotransformasyonlar popülerlik kazanmıştır. O zamandan beri, steroidler de dahil olmak üzere çeşitli substrat grupları mikrobiyal biyotransformasyonlar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mükemmel regio ve stereoseçicilikleri nedeniyle mikrobiyal steroid biyotransformasyonları, birçok önemli steroid hormon ve ilacın üretiminde yaygın bir kullanım alanı bulmuştur. Son yıllarda çok sayıda mikrobiyal steroid biyotransformasyonu tanımlanmıştır. Mikrobiyal biyotransformasyonların verimliliğini artırmanın yanı sıra yeni, yararlı mikroplar ve reaksiyonlar keşfetmek için hala tonlarca şaşırtıcı çaba sarf edilmektedir. Çok sayıda farklı mantar, 1952'de ilk mikrobiyal hidroksilasyonun tanımlanmasından bu yana biyotransformasyon reaksiyonları için sürekli olarak en çok araştırılan tam hücre sistemlerinden biri olmuştur. Çok sayıda steroid türü çeşitli mantarlar tarafından biyotransformasyona uğratılmıştır. Bu biyotransformasyonlardan mikrobiyal hidroksilasyonlar, Baeyer-Villiger oksidasyonları ve 5α-redüksiyonu dahil olmak üzere çeşitli ilgi çekici sonuçlar elde edilmiştir. Bu çalışmada DHEA olarak da bilinen dehidroepiandrosteron 9, Penicillium olsonii MRC 500780 küfü ile 5 gün boyunca inkübe edilmiştir. Küf için 1 L damıtılmış su içinde besiyeri hazırlanmıştır. Besiyeri 250 mL'lik 10 erlenmeyer şişesine eşit olarak dağıtılmış ve bir otoklav ile sterilize edilmiştir. Bu şişelere fungus inoküle edilmiştir. Erlenler 25 ºC'de 3 gün boyunca çalkalayıcıda inkübe edilmiş ve DMF içindeki substrat bu erlenlere aseptik olarak eklenmiştir. Tüm şişeler aynı koşullar altında 5 gün daha inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra, mantar miseli vakum altında süzülerek besiyerinden ayrılmıştır. Miselyum daha sonra etil asetat ile ekstrakte edilmiştir. Ekstraktlar susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmuş ve vakumda buharlaştırılarak kahverengi ve sakız kıvamında olan bir madde elde edilmiş ve daha sonra silika jel 60 üzerinde kromatografisi yapılmıştır. Kromatografi çalışmasından androst-4-ene-3,17-dion 5 (8%), 15α-hidroksiandrost-4-ene-3,17-dion 15(21%), 3β,7β-dihidroksiandrost-5-ene-17-on 21(8%), 3β,7α-dihidroksiandrost-5-ene-17-on 22 (29%) ve 15α,17β-dihidroksiandrost-4-ene-3-on 23(6%) bileşikleri elde edilmiştir. Bu bileşiklerin yapıları, başlangıç maddesinin erime noktası, NMR ve IR spektrumları ile kendilerine ait erime noktası, NMR ve IR spektrumları karşılaştırılarak ortaya çıkarılmıştır.

Natural products not actively involved in creating and developing living things for the organisms they contain usually provide significantly better living conditions. Natural products are receiving increased attention because of their effects on other living things. Despite the fact that these compounds are numerous and have very different structures, due to some similarities in their biosynthesis, they are usually classified as terpenes, alkaloids, steroids, phenolic compounds, specialized carbohydrates, specialized peptides, polyketides, fatty acids, and fatty acid derivatives. One significant category of natural compounds is steroids. One of the most significant and well-known steroids is the cholesterol molecule that controls the fluidity of membranes in both humans and animals. Some substances with crucial roles, like vitamin D3, bile acids, and steroids, are biosynthesized from cholesterol. Cholesterol-derived steroid hormones are classified into five groups: progestogens (progestins), estrogens, androgens, androgens, mineralocorticoids, and glucocorticoids. The main circulating steroid usually classified as androgen is androgen, which encourages secondary sexual characteristics in males, such as dehydroepiandrosterone (DHEA). Biotransformations are chemical reactions when enzymes operate on materials that are not their typical substrates. The biotransformation-related enzymes can function in various biological systems or as free, fixed molecules. The most often utilized biological systems for biotransformations include bacteria, yeasts, and molds. These microbes can be used for microbial biotransformations, which have numerous benefits over current chemical synthesis techniques. These microorganisms can be immobilized on appropriate surfaces or employed freely to carry out microbial biotransformations. Due to the high regioselectivity and stereoselectivity of mold enzymes, microbial steroid biotransformations by molds are widely used to obtain many more important and functional compounds. The aim of this study was to investigate how dehydroepiandrosterone 9, also known as DHEA, is metabolized in Penicillium olsonii MRC 500780 isolate. For this purpose, fresh subcultures were periodically prepared for Penicillium olsonii MRC 500780 mold before the biotransformation experiment. Afterwards, the medium for the mold was prepared and distributed to the flasks and sterilized in an autoclave. The mold in the freshest subculture was inoculated into these flasks under sterile conditions, and the flasks were left to incubate for 3 days. DHEA 9 was added under sterile conditions to these flasks where enough mold grew and incubated for 5 days. After incubation, the medium was filtered, and possible metabolites were extracted to the organic phase by ethyl acetate extraction. The metabolites in the residue obtained by evaporation of the ethyl acetate extracts were separated by column chromatography. Structure determination of the metabolites was carried out by melting point determination, NMR and IR spectroscopy. Structure determinations revealed that biotransformation of DHEA 9 by Penicillium olsonii MRC 500780 resulted in the compounds androst-4-ene-3,17-dione 5 (8%), 15α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione 15 (21%), 3β,7β-dihydroxyandrost-5-ene-17-one 21 (8%), 3β,7α-dihydroxyandrost-5-ene-17-one 22 (29%) and 15α,17β-dihydroxyandrost-4-ene-3-one 23 (6%).