Kenevir tohum proteinlerinin ultrases, yüksek basınç ve manotermosonikasyon uygulamaları ile modifikasyonu = Modification of hemp seed proteins using ultrasound, high pressure and manotermosonication treatments

Abstract

Dünya nüfusundaki hızlı artış trendi gelecekte gıda talebini karşılamada zorluklar yaşanacağına işaret etmektedir. Ayrıca, küresel salgınlar, savaşlar ve iklim değişiklikleri gıda zincirindeki olası sıkıntıları tetiklemektedir. Bu noktada sağlıklı beslenme düzeninde kilit rol oynayan proteinlerin tedariğinde yakın gelecekte sıkıntılar meydana geleceği öngörülmektedir. Özellikle hayvansal protein kaynaklarıyla ilişkili ekonomik, etnik ve dini nedenlere ek olarak bu kaynakların yarattığı çevre ve sağlık endişeleri araştırmacıları alternatif protein kaynakları üzerinde çalışmaya yönlendirmiştir. Bu bağlamda, bitkisel protein kaynakları bol, çeşitli, ucuz ve erişilebilir olmasıyla küresel markette hızlı bir şekilde yer edinmiştir. Artan tüketici bilinciyle birlikte sağlıklı, dengeli ve vejetaryen beslenmeye eğilim bitkisel protein talebine ivme kazandırmıştır. Özellikle gıda işleme atıklarının alternatif protein kaynağı olarak değerlendirilmesi, çevresel geri dönüşümü destekleyerek sürdürülebilir, katma değerli ve yenilikçi çözümler üretmesiyle önem taşımaktadır. Kenevir; lifi, tohumu ve yağı için uzun yıllardan beri yetiştirilen çok fonksiyonlu endüstriyel bir bitkidir. Son yıllarda yapılan yasal düzenlemelerle uyuşturucu (Marijuana) ve endüstriyel kenevir çeşitlerinin (Cannabis sativa, d–9–tetrahidrokannabinol (THC) <%0,3) ayrımının net bir şekilde yapılması çok değerli bileşenleri bünyesinde barındıran kenevir tohumu üzerindeki çalışmaları artırmıştır. Kenevir tohumu özellikle yapısındaki yüksek kaliteli protein ve yağ içeriğiyle dikkat çekmektedir. Yağ ekstraksiyonu sonrasında kalan küspe, %55–60 yüksek kaliteli -esansiyel amino asitlerce zengin- bir protein kaynağı olarak ortaya çıkmaktadır. Kenevir tohum proteini (KTP), düşük alerjenitesi, yüksek sindirilebilirliği ve biyoaktif özellikleri ile bilinmektedir. Bu açıdan KTP, gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılan ancak genetik modifikasyon, alerjenite ve düşük sindirilebilirliğiyle bilinen soya proteinine alternatif olarak görülmektedir. KTP'nin ekmek, et, kahvaltılık gevrek ve dondurma gibi gıda formülasyonlarının yapısında çeşitli amaçlarla kullanıldığı çalışmalar literatürde yer almaktadır. Buna rağmen KTP'nin gıda endüstrisinde yaygın kullanımı bulunmamaktadır. Bu durumun altında yatan nedenler, KTP'nin diğer bitkisel protein kaynakları gibi düşük çözünebilirliğe sahip olmasıdır (nötr pH'da ~%20). Gıda bileşen ve katkı maddelerinin gıda formülasyonlarında tercih edilebilmesi, sahip oldukları çoklu fonksiyonel özelliklerine bağlıdır. Düşük çözünebilirlik; protein süspansiyonlarının emülsiyon, köpük ve jel oluşturma gibi diğer birçok fonksiyonel özelliğini birincil derecede etkilediği için KTP'nin bu handikabı aşılması gereken bir problemdir. Bu doktora tez çalışması kapsamında, kenevir tohum proteinlerinin fonksiyonel özelliklerinin geliştirilmesi için fiziksel (ısıl olmayan) ve kimyasal modifikasyon tekniklerinin tekil ve kombine kullanımının etkinliği üzerine odaklanılmıştır. Çalışmada ülkemizdeki ilk tescilli kenevir tohum çeşidi olan "Narlısaray" kullanılarak bu çeşidin tekno fonksiyonel özelliklerinin uluslararası literatüre girmesi sağlanmıştır. Fiziksel tekniklerden; ultrases homojenizasyon (USH), yüksek basınç homojenizasyon (YBH), manotermosonikasyon (MTS) ve kimyasal tekniklerden; pH değiştirme uygulamasına dair bulgular iki ayrı bölümde ayrıntılı şekilde sunulmuştur. Isıl olmayan teknikler; yenilikçi, güvenli, verimli ve yeşil uygulamalar olarak bilinmektedir. Enzimatik ve ısıl uygulamaların yüksek maliyet ve proses kontrol zorlukları fiziksel tekniklerin önemini arttırmaktadır. Kavitasyon temelli USH, HPH ve MTS uygulamalarının ısıtma, dinamik çalkalama, kayma gerilmeleri ve türbülans gibi etkileri protein süspansiyonlarında çeşitli modifikasyonlara yol açabilmektedir. Özellikle yurtdışında kullanılan dünyadaki tek sürekli sistemde çalışan MTS cihazı, USH teknolojisinin basınç ve sıcaklık uygulamasıyla birleştirildiği bir teknolojiyi yansıtmaktadır. USH uygulamasının tek başına kullanılması proteinlerde istenilen değişikliği sağlayamazken, kombine sistemlerle bu sorun aşılabilmektedir. Ayrıca USH uygulamasının modifikasyon verimini artırmak için 15–30 dakikaya kadar uzayan işlem süresi, enerji ve zaman tüketiminin yanı sıra endüstride uygulanabilirliğini de azaltmaktadır. MTS sisteminin kullanımı ile aynı etkiyi sağlayacak olan işlem süresinin 1,4 dakikaya kadar düşme potansiyeli bulunmaktadır. MTS uygulanmasındaki ılımlı sıcaklık ve basınç kombinasyonu kavitasyonel etkileri teşvik edici olabilmektedir. Aynı zamanda pH değiştirme bu fiziksel uygulamalara kolayca uyarlanarak, uygulama yapılan proteinlerin modifikasyonu üzerindeki etkinin artmasına katkı sağlayabilmektedir. Tez çalışmasının bir kısmı Türkiye'de ve bir kısmı Amerika'da gerçekleştirildiği ve farklı kenevir tohumları kullanıldığı için çalışma iki bölüme ayrılmıştır. Tez çalışmasının birinci bölümünde, USH uygulamasının KTP'nin fonksiyonel, fizikokimyasal, morfolojik ve biyoaktif özellikleri üzerine etkisi incelenmiş, bu uygulamanın KTP'nin özelliklerini modifiye etme potansiyeli ortaya koyulmuştur. Öncelikle, USH proses parametrelerinin (genlik, süre, konsantrasyon) KTP'nin çözünürlük ve partikül boyut yanıtları üzerine etkisi belirlenmiştir. USH işleminin optimal proses koşulları, KTP'nin maksimum çözünürlük ve minimum partikül boyut yanıtlarına göre 37 W/cm2 akustik yoğunlukta, 7,8 dakika işlem süresi ve %6,9 protein konsantrasyonu (20 kHz frekansta) olarak belirlenmiştir. Yüksek R2 ve uyum değerleri sunan çözünürlük ve partikül boyut modelleri gerçek analiz koşullarında doğrulanmıştır. Optimum koşullarda USH uygulanan KTP'nin (KTP-USH) elektroforetik profilinde önemli bir değişiklik meydana gelmemiştir, ancak amino asit profili değişmiştir. FT-IR spektrumu, USH uygulaması ile proteinin Amid 1 ve 2 bölgelerindeki kaymaları ortaya çıkarmıştır. USH uygulamasından sonra Amid 1 (1700–1600 cm-1) bölgesindeki pik 1636 cm-1'den 1629 cm-1'e kaymıştır. Amid 1 bölgesindeki bu kayma, USH uygulamasından sonra KTP'nin ikincil yapısındaki değişikliğe işaret etmektedir. KTP'nin Amid 2 bölgesindeki pik ise 1529 cm-1'den 1524 cm-1'e kaymıştır. FT-IR spektrasında, daha yüksek değerlere doğru görülen kaymalar, USH uygulamasından sonra proteinin α-heliks yapıdan rastgele sarmal ve β-sheet yapılarına dönüşmesi ile ilişkilendirilebilir. USH işleminden sonra KTP'nin denatürasyon sıcaklığında artış, denatürasyon entalpisinde ise azalış görülmüştür. USH uygulamasından sonra, KTP'nin çözünürlüğü (%78), serbest SH grup içeriği (%59) ve zeta potansiyeli (%25) artarken, partikül boyutu (%46) azalmıştır. KTP-USH'nin emülsifikasyon, yağ absorpsiyon ve köpük oluşturma özelliklerinin KTP'ye kıyasla arttığı, en düşük jel konsantrasyonunun ise azaldığı saptanmıştır. Ayrıca KTP'nin antioksidan özelliği, USH uygulaması ile %38 oranında artmıştır. Tez çalışmasının ikinci bölümünde YBH ve MTS uygulamaları ve bunların pH değiştirme ile kombine kullanımlarının KTP'nin fizikokimyasal, morfolojik ve fonksiyonel özellikleri üzerindeki etkisi araştırılmıştır. MTS uygulamasının optimum işlem parametreleri KTP'nin en yüksek çözünürlük ve en düşük partikül boyutunu verecek şekilde 50°C, 200 kPa ve 90 s olarak belirlenmiştir. Uygulanan modifikasyon işlemleri sonrasında, KTP'nin ikincil yapısındaki değişim FTIR ve CD verileri ile doğrulanmıştır. Uygulamalar öncesinde KTP'nin ikinci yapı dağılımı %4,5 α-heliks, %37,9 β-sheet, %14,7 β-turn ve %42,9 rasgele sarım olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamalar sonrasında proteinin ikincil yapı dağılımında genel bir eğilim olarak, α-heliks ve β-sheet oranı azalırken, β-turn ve rastgele sarım oranı artmıştır. İkincil yapı formlarındaki değişiklik, α-heliks ve β-sheet formlarından β-turn ve rastgele sarım formlarına olası dönüşleri göstermektedir. Modifikasyon uygulamaları sonrasında pH12MTS için HSP'nin maksimum floresan yoğunluk (FImax) değeri 13768 Au'dan 43268 Au'a yükselmiştir. pH12MTS izolatı diğer izolatlara göre en yüksek floresans yoğunluğuna sahip iken, bunu sırasıyla HPH, MTS, pH12HPH ve pH12 izolatlarının floresans yoğunluk değerleri izlemiştir. KTP'nin maksimum floresan yoğunluğundaki dalga boyu (λmax) değeri 334 nm civarındayken, modifiye edilmiş tüm izolatlar daha uzun dalga boylarına (336 nm) doğru kaymalar göstermiştir. Bu batokromik kayma, proteinin iç kısımlarında gömülü olan triptofan aminoasidinin protein yüzeyine yöneliminin ve sıvı ortamdaki polaritenin artmasıyla ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, tüm uygulamalardan sonra izolatların termal davranışı ve XRD kristal yapısının oranı değişerek modifiye edilen KTP'nin daha düzensiz yapılar gösterdiğini kanıtlamıştır. KTP'nin partikül boyutu (365,87 nm), pH12MTS izolatında 112,67 nm'ye kadar düşmüştür. Modifiye edilen izolatların zeta potansiyelleri ve serbest SH grup içerikleri kavitasyonel kuvvetlerin ve pH değiştirme uygulamalarının kombine etkileri sonucu üçüncül yapılarda meydana gelen değişikliklerin kanıtı olarak artmıştır. pH12MTS izolatının çözünürlüğü, uygulama yapılmayan KTP'ye kıyasla %52 oranında artmıştır. Ayrıca, pH12MTS izolatının emülsiyon aktivitesi ve stabilitesi, KTP'ye kıyasla sırasıyla 2,11 ve 2,15 kat artışlarla diğer uygulamalara kıyasla en yüksek değerleri göstermiştir. Ayrıca, modifikasyon işlemleri sonrasında, KTP'nin %84,23 olan sindirilebilirliği pH12MTS uygulamasında %95,46'ya artış göstermiştir. Bu durum, protein agregatlarının makromoleküler yapısında kavitasyonel etkilerle meydana gelen kısmi açılmalar ve kırılan protein-protein arası interaksiyonlarla ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, bu doktora tez çalışması, kenevir tohum proteinlerinin teknolojik özelliklerinin geliştirilmesinde ısıl olmayan ve kimyasal modifikasyon yöntemlerinin önemli rol oynadığını göstermiştir. KTP'nin yapısında hem farklı modifikasyon tekniklerinin ortaya çıkardığı değişimler kıyaslanmış hem de KTP'nin detaylı tekno fonksiyonel profili ortaya koyulmuştur. Proses parametrelerinin farklı fonksiyonel özellikleri maksimize edecek şekilde optimize edilebileceği gösterilmiştir. Fonksiyonel özelliklerde meydana gelen değişimler fizikokimyasal ve morfolojik analizlerle de uygun bir korelasyon sergilemiştir. Özellikle MTS sistemi, klasik USH ve YBH işlemlerine kıyasla daha kısa proses süresi ile daha etkin bir modifikasyon sağlayan, gelecek vaat eden bir teknik olarak görülmektedir. Aynı zamanda kombine pH değiştirme uygulamaları da fiziksel modifikasyonların etkinliğini arttırmıştır. Modifiye edilen KTP'lerin, daha yüksek çözünürlük, emülsiyon, köpük ve jel oluşturma özelliklerine sahip olması, etkin gıda bileşenleri için arzu edilen tekno-fonksiyonel özelliklere sahip bir gıda bileşeni olarak gıda proseslerinde kullanım potansiyeline sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Aynı zamanda, kullanılan USH, YBH ve MTS teknolojileri işlevselleştirilmiş ve katma değerli farklı proteinlerin eldesinde, biyoaktif bileşenlerin kapsüllenmesinde ve biyopolimer ambalaj materyallerinin elde edilmesinde kullanılma potansiyeli söz konusudur.

The global population is anticipated to reach 10.4 billion by 2100, which will result in considerable challenges to meet the protein demand in future. Furthermore, the COVID-19 pandemic has markedly expedited the transition to alternative protein sources, owing to the disruption in the worldwide food supply chain. Recent studies have reported the favorable impact of plant-based diets on mitigating the severity of COVID-19. Plant proteins have been attracting attention due to various reasons, such as economic, ethnic, and religious factors, as well as consumers' growing awareness of sustainable and healthy diet. All these factors have led to increase the popularity of plant-based products, which have become more readily accessible, diverse, and affordable in the market. The global plant protein market's worth was $12.2 billion in 2022, with a projected Compound Annual Growth Rate (CAGR) of 7.3% over the next five years. The escalating demand has triggered the pursuit of utilizing industrial plant waste, which was previously considered an environmental problem or used as animal feed, as an alternative, low-cost, and clean-labeled protein source. Hemp seed, an industrial by-product, has garnered substantial attention in recent years due to its rich protein and oil content. Hemp seed protein (HSP) is recognized for its high digestibility, low allergenicity, and bioactive properties. Cannabis sativa L. (C. sativa L.), a hemp variety containing a low amount of d–9–tetrahydrocannabinol (THC) (0.2%), is typically classified into two different types. As the demand for hemp fiber from industries such as paper, biodegradable plastics, textiles, and fuel continues to increase, so does the quantity of hemp seeds that are discarded as waste. Hemp seed is a superb by-product, with high-quality protein (20–25%) and oil (30–35%). The meal obtained from the seeds after hemp oil extraction contains roughly 55–60% protein. Comparisons of hemp seed proteins with egg white and soy protein in terms of nutritional value and digestibility have indicated that hemp protein can be an alternative food additive. Additionally, hemp seeds exhibit favorable health effects, including the ability to reduce blood pressure and cholesterol levels. This PhD thesis focused on evaluating the efficacy of non-thermal and chemical modification techniques, both separately and in combination, for enhancing the functional properties of hemp seed proteins. Ultrasound homogenization (USH), high pressure homogenization (HPH), manothermosonication (MTS) from non-thermal techniques, and pH shifting from chemical techniques were considered to investigate their effects on the functional, physicochemical, morphological, and bioactive properties of hemp seed proteins. Ultrasound homogenization (USH) is a non-thermal technique based on a combination of effects such as cavitation, heating, dynamic agitation, shear stresses, and turbulence. Cavitation bubbles, microjets, micro-turbulence, high-speed interparticle collisions, and microporous particle disruption cause modifications. The bursting of these bubbles generates high temperature and pressure values (approximately 50 MPa and 5500 K) around the bubble, leading to several reactions in the solution. In the first part of the thesis, the optimal processing conditions for the USH treatment were determined as 6.9% protein concentration (at a frequency of 20 kHz), 37 W/cm2 acoustic intensity, and 7.8 minutes processing time based on maximum solubility and minimum particle size responses of HSP. The solubility and particle size responses were used to obtain models with high R2 and lack-of-fit values. After USH treatment, the solubility of HSP (78%), free SH group content (59%), and zeta potential increased (25%), while the particle size decreased (46%). Although there was no significant change in the electrophoretic profile of HSP-USH under optimum conditions, the amino acid profile of HSP-USH differed from that of HSP. Moreover, the emulsification, oil absorption, and foaming properties of HSP-USH were found to increase compared to HSP, while the lowest gel concentration decreased. The shift in the amide 1 (1700–1600 cm-1) region from 1636 cm-1 to 1629 cm-1 after USH application indicates a partial alteration in the secondary structure of HSP. The amide 2 region (1580–1480 cm-1) is characterized by dominant N–H (40-60%), C–N (18-40%), and C–C (10%) vibrations. The shift in the peak number from 1529 cm-1 to 1524 cm-1 in the Amid 2 region (1580–1480 cm-1) of HSP indicates alterations in α-helix and β-sheet structures. The shifts towards higher values suggest the transformation of the protein into random coil and β-sheet structures following USH application. After USH treatment, an increase in the denaturation temperature and proportion of β-structure for the secondary structure distribution was observed. Furthermore, the USH treatment led to a 38% increase in the antioxidant properties of HSP. The aim of the second part is to examine the impact of high-pressure homogenization (HPH) and manothermosonication (MTS) processes, as well as their combined employment with pH-shift treatments, on the physicochemical, morphological, and functional attributes of hemp seed proteins. The MTS represents an innovative technology in which ultrasound homogenization (USH) technology is integrated with pressure and temperature application in a continuous system. While the alone-USH technology cannot yield the desired protein alterations, this limitation can be surmounted using integrated systems. Moreover, the efficacy of USH application is restricted by the requirement of an extended processing time of up to 15–30 minutes, thereby hindering its industrial applicability. In contrast, the MTS system has reduced the processing time from 15.9 minutes to 1.4 minutes, providing similar results with a more moderate temperature application. This makes it a more feasible and efficient alternative to thermal modification approaches. Chemical modification of proteins can be achieved through various techniques (phosphorylation, Acylation, pH-shifting, etc.), which pH shifting stands out as a straightforward and safe approach among these techniques. Extensive studies have shown that polypeptide structures of proteins can be altered by exposing them to highly acidic or alkaline pH treatments (pH 1.5–3.5 or pH 10–12). The rationale behind this is that the polypeptide chains of proteins unfold at extreme pH levels and subsequently refold and rearrange when the pH is adjusted to 7.0. The pH shifting process induces partial denaturation, resulting in tertiary structure losses, side chain interactions, and the release of sulfhydryl and hydrophobic nuclei, leading to the formation of "molten globules." To enhance the modification of proteins, researchers often combine the pH shifting technique with thermal or non-thermal technologies. One such non-thermal technique is high-pressure homogenization (HPH), which has gained popularity in the food industry and among researchers for its ability to modify the molecular structure, functionality, and physicochemical properties of proteins. HPH operates on the principle of subjecting a suspension to high pressure, causing it to flow continuously through a narrow valve, resulting in high turbulence, shear stress, cavitation, and a rise in temperature. The optimal parameters for the MTS process were determined to be 50°C, 200 kPa, and 90 s, based on the highest solubility and the lowest particle size. The solubility of pH12MTS isolate increased by 52% compared to untreated HSP. Furthermore, the emulsion activity and stability of pH12MTS isolate exhibited the highest values with 2.11- and 2.15-fold increases, respectively, compared to HSP. The particle size decreased from 365.87 nm to 112.67 nm following pH12MTS treatment. The zeta potential, free SH group content, and fluorescence intensity of the modified isolates increased due to the combined effects of cavitation forces and pH shifting treatments, providing evidence of tertiary structural changes. After the applied modification processes, a change in the secondary structure of HSP was observed, which was evidenced by the decrease of α-helix forms and the increase of random coil forms as a result of FTIR and CD data. The secondary structural distribution of the HSP sample was found to be 4.5% α-helix, 37.9% β-sheet, 14.7% β-turn, and 42.9% random coil. As a general trend, the ratio of α-helix and β-sheet decreased, while the ratio of β-turn and random coil increased in the secondary structure composition of all treated samples. The change in secondary structure indicated that the possibility of a reversal from α-helix and β-sheet to β-turn and random coil. After the modification applications, the FImax value of HSP increased from 13768 Au to 43268 Au for pH12MTS. The pH12MTS isolate demonstrated the highest fluorescence intensity compared to the other isolates, followed by the fluorescence intensity values of HPH, MTS, pH12HPH, and pH12 isolates, respectively. While the λmax value was approximately 334 nm for untreated HSP, all modified isolates exhibited shifts towards longer wavelengths (336 nm). These shifts towards longer wavelengths are known as bathochromic shifts or redshifts. The bathochromic shift is caused by the surface orientation of the tryptophan embedded in the interior of the protein and the increase in polarity in the liquid medium. In addition, all applications changed the thermal behavior of the isolates and the proportional distribution of the crystal structure, causing the modified HSP to exhibit more irregular forms. After the modification processes, the digestibility of HSP increased from 84.23% to 95.46% after pH12MTS treatment. In summary, this PhD thesis has established that various non-thermal and chemical modification techniques can significantly enhance the technological properties of hemp seed protein. The study has highlighted that optimal process parameters are critical for obtaining the desired functional properties. Compared to the conventional USH process, the MTS method provided a more effective modification with a shorter processing time. The modified hemp seed proteins exhibit potential as multi-functional food ingredients, offering desirable techno-functional properties for food products. Additionally, the USH, HPH, and MTS technologies employed in this research can be applied to obtain functionalized, value-added protein ingredients, encapsulation, and biopolymer packaging materials.