Extracellular bıosynthesis and characterization of zinc oxide and nisin-loaded zinc oxide nanoparticles using bacillus subtilis zbp4 = Çinko oksit ve nisin-yüklü çinko oksit nanopartiküllerinin bacillus subtilis zbp4 ile hücre dışı biyosentezi ve karakterizasyonu

Abstract

Son yıllarda mikroorganizmalar aracılığıyla çinko oksit nanopartiküllerinin (ZnO NP) sentezine olan ilgi, daha güvenli bir yöntem olması nedeniyle artmıştır. Kimyasal ve fiziksel sentez yöntemlerine alternatif olarak ZnO NP'lerin biyosentezi, uygun maliyetli, çevre dostu ve geniş ölçekli üretim olanakları nedeniyle daha avantajlıdır. Bu çalışma, 1 Ocak 2021 - 1 Haziran 2022 tarihleri arasında Sakarya Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, ZnO NP sentezleme yeteneğinde olan Bacillus suşlarının belirlenmesi ve nanopartikül biyosentezinin optimizasyonu ile nanopartiküllerin özellikle potansiyel uygulama alanlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için, daha önce izole edilmiş olan ve Sakarya Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Gıda Biyoteknoloji kültür koleksiyonunda bulunan 45 farklı Bacillus suşunun ZnO NP biyosentez yetenekleri araştırılmıştır. Bakteriler nutrient broth besiyerinde 33 °C'de 24 saat geliştirilmiş ardından hücreler santrifüj yardımıyla uzaklaştırılmış ve elde edilen hücresiz süpernatantta ZnO NP oluşumu UV-VIS spektrofotometre ile absorbans taraması yapılarak belirlenmiştir. Yapılan tarama çalışması sonucuna göre bir toprak örneğinden izole edilmiş olan Bacillus subtilis sp ZBP4 spektrofotometrede 341 nm dalga boyunda yüzey plasmon rezonansından kaynaklanan nanaopartiküllere özgü bir absorbans piki vermiştir. Ayrıca, beyazdan sarıya renk değişimi de nanopartikül oluşumunun bir göstergesi olmuştur. Buna dayanarak Bacillus subtilis spp ZBP4 ZnO NP sentezleme yeteneğinde olduğu anlaşılmış ve sonraki çalışmalara bu bakteri ile devam edilmiştir. Bacillus subtilis ZBP4 ile hücre dışı ZnO NP biyosentezinin optimizasyonu için farklı reaksiyon pH'ları (5-9), sıcaklık (30-40°C), ZnSO4.7H2O konsantrasyonu (2-10 mM) ve reaksiyon sürelerinde (0-72 saat) biyosentezler gerçekleştirilmiştir. Biyosentez oranı reaksiyon ortamından alınan örneklerin absorbanslarının UV-VIS spektrofotometrede 341 nm dalga boyunda ölçülmesi ile belirlenmiştir. Yapılan çalışma sonucunda, Bacillus subtilis ZBP4'ün ZnO NP biyosentezi için optimum koşulların 8 mM ZnSO4.7H2O, pH 7.5 pH, 33°C ve 24 saat olduğu belirlenmiştir. Bir diğer çalışmada da ZnO NP'lerinin etkinliğini artırmak için optimum kuşullarda hazırlanan biyosentez ortamına farklı konsantrasyonlarda (5, 10, 15 mg/mL) nisin eklenerek nisin yüklü ZnO NP (N-ZnO NP) üretimi gerçekleştirilmiştir. Ortama 10 mg/mL nisin eklendiğinde biyosentezin en iyi düzeyde olduğu saptanmıştır. Çalışmanın bir diğer aşamasında optimum koşullarda elde edilen ZnO NP ve nisin-yüklü ZnO NP'lerinin karakterizasyonu yapılmıştır. Bunun için üretilen nanopartiküller santrifüj yardımıyla sıvı ortamda çöktürülüp yıkanmış ve ardından kurutulmuştur. Kurutulmuş nanopartiküllerin morfolojik özellikleri Alan Emisyon Taramalı Elektron Mikroskobu (FESEM) ve Geçirgen elektron mikroskobu (TEM) ile, elemental kompozisyonu Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (EDS), kristal yapısı X-ışını kırınımı (XRD) spektrometresi ile belirlenmiştir. Ayrıca, zeta potansiyeli ölçümü ile nanopartiküllerin dispersiyon stabilitesi, ve Fourier Dönüşümü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ile de nanopartikül yüzeylerinde kaplama ajanı olarak görev yapan ve stabilizasyonu sağlayan organik maddelerin varlığı incelenmiştir. TEM ile elde edilen görüntülere göre, nanopartiküllerin düzensiz küresel şekilde oldukları ve çaplarının da 50 nm'nin altında olduğu saptanmıştır. TEM analiziyle ZnO NP ve N-ZnO NP'lerin ortalama çapları sırasıyla 26 ve 23 nm olarak belirlenmiştir. N-ZnO NP'lerinin FESEM görüntülerinde nisinin nanopartikül yüzeylerini ağ şeklinde kapladığı gözlenmiştir. Bu nedenle, ZnO NP'lerinin morfolojik yapısı FESEM ile net olarak görüntülenebilmesine karşın N-ZnO NP'lerinin morfolojisi incelenememiştir. ZnO NP'lerinin FESEM görüntülerinde, TEM görüntülerine benzer şekilde düzensiz küresel şekillerde nanopartiküller gözlenebilmiştir. Bu analiz ile nanopartikül boyutlarının 21-59 nm arasında olduğu ve ortalama partikül çapının da 35 nm olduğu belirlenmiştir. Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (EDS) ile elde edilen nanopartikül örneklerinin elemental dağılımı incelenmiş ve ortamda elemental Zn ile birlikte C, O, N, P gibi elementlere de rastlanmıştır. Bu çalışma ile hem nanaprtiküllerin varlığı doğrulanmış hem de ortamda nanopartiküller için kaplama ajanı görevi gören ve stabilitenin artmasını sağlayan organik moleküllerin olduğu tespit edilmiştir. Yapılan ölçümlere göre, ZnO NP ve N-ZnO NP'lerinin zeta potansiyeli -19 ve -17,7 mV olarak belirlenmiş olup nanopartiküllerin dispersiyon stabilitelerinin orta seviyede olduğu anlaşılmıştır. FTIR sonuçları organik maddelerin varlığı göstermiştir. Nanopartiküllerin enerji band aralığı UV-VIS spektrumlarından yararlanılarak Tauc eşitliğinden hesaplanmış ve 3.36 eV olarak belirlenmiş olup elde edilen sonuç nanopartiküllerin yarı-iletken özellikte olduğunu göstermiştir. Elde edilen nanopartiküllerin Gram-pozitif (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve Listeria monocytogenes ATCC 7644) ve Gram-negatif (Escherichia coli Tip 1, Escherichia coli O157:H7 NCTC 12900, Pseudomonas aeruginosa)'a gıda patojenlerine karşı antimikrobiyal etkileri disk difüzyon yöntemiyle belirlenmiştir. Yapılan çalışma sonucunda hem ZnO NP hem de N-ZnO NP'lerinin tüm bakterilere karşı antimikrobiyal etkisinin olduğu, minimum inhibisyon konsantrasyonlarının da 1-2 mg/mL arasında olduğu belirlenmiştir. Ayrica, N-ZnO NP'ler, tek başına ZnO NP'lerin ve serbest nisinin etkisine kıyasla patojen bakterilere karşı yüksek etkinlik gösterdiği gözlenmiştir. Bir diğer çalışmada da nanopartiküllerin sıvı besiyerinde antimikrobiyal etkileri belirlenmiştir. Bunun için, belli konsantrasyonlarda (0, 30, 75, 150 µg/mL) nisin, ZnO NP ve N-ZnONP'leri içeren Tryptic Soy Broth'ta Listeria monocytogenes ATCC 7644 ve Staphylococcus aureus ATCC 25923 geliştirilmiş ve belli aralıklarla bakteri gelişimi Mcfarland densitometresi ile ölçülmüştür. Serbest nisin ve ZnO NP içeren ortamlara kıyasla, N-ZnO NP içeren ortamlarda bakteri gelişmesinin önemli oranlarda inhibe edildiği, 150 µg/mL ZnO NP içeren ortamın bacterisidal etki gösterdiği belirlenmiştir. Bu çalışma ile ZnO NP'lerinin nisin yüklemesiyle yüksek oranda antimikrobiyal özellik kazandığı anlaşılmıştır. Ayrıca, ZnO NP ve N-ZnO NP'lerinin antioksidan aktiviteleri de 2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikalini süpürme aktivitesi analizi ile belirlenmiştir. ZnO NP'lerinin antioksidan aktivitesi düşük olmakla beraber N-ZnO NP'leri ile antioksidan aktivite iki katına çıkmıştır. Bu çalışma sonucunda, yerel bir izolat olan Bacillus subtilis ZBP4'ün ZnO NP biyosentezi için kullanılabilecek özellikte bir mikroorganizma olduğu ve bununla üretilen ZnO NP'lerin iyi bir antimikrobiyal ajan olabileceği belirlenmiştir. Ayrıca biyosentez ortamına nisin eklendiğinde üretilen nanopartiküllerin hem antibakterial hem de antioksidan özelliklerinin önemli oranda iyileştirilebileceği ortaya konmuştur.

In recent years, the biosynthesis of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) is gaining considerable interest as an alternative to chemical and physical routes, due to its cheap, environmentally friendly, and large-scale manufacturing potential. This study was conducted in the laboratories of the Food Engineering Department at Sakarya University from 1 January 2021 to 1 June 2022. Firstly, the biosynthesis of ZnO NPs was screened using 45 different Bacillus strains previously isolated from soil and food samples. The biosynthesis reactions were performed extracellularly after centrifugation of bacterial culture grown in nutrient broth for 24 h. The best isolate (Bacillus subtilis ZBP4) was selected and the reaction conditions affecting the biosynthesis of ZnO NPs were optimized, including reaction pH (5-9), temperature (30-40°C), ZnSO4.7H2O concentration (2- 10 mM) and incubation time (0-72 hours) and the optimum conditions were determined at 8 mM ZnSO4.7H2O concentration, pH 7.5, 33 oC and 24 h. The color change from white to yellow was used to preliminary examine the production of ZnO NPs, and the sharpe peak was identified to be at 341 nm.The crystalline nature of synthesized ZnO NPs are characterized with UV–VIS spectroscopy. Also, the size and shape of the synthesized NPs were determined by Field Emission Scanning Electron Microscopy (FESEM) and Transmission electron microscopy (TEM), and the NPs displayed a quasi-spherical form with nanoscale of 26 nm. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) were used to confirm nanoparticle synthesis. The formation of nisin loaded Zinc Oxide nanoparticles (N-ZnO NPs) were verified by using UV-VIS spectroscopy, the sharp peak and high absorbance of the reaction mixture was observed at 341 nm created by the surface plasmon resonance (SPR) of nanoparticles. TEM was used to analyze the size and shape of the N-ZnO NPs and NPs shapes were quasi-spherical with diameters ranging from 14-40 nm. The nanoparticles synthesis were validated by Energy-dispersive X-ray spectroscopy analysis. X-ray diffraction used to identify the natural of NPs, which showed amorphous and alone broad peaks at 2θ angles (2θ = 26.99°). The active groups attributed to presence of protein were detected by FTIR that acted as reducing and stabilizing agents. The zeta potential measurements of NPs exhibited negative surface charges were ˗19.0 and ˗17.7 mV for ZnO and N-ZnO NPs respectively, indicating that the particles are moderately stable. Results showed that N-ZnO NPs synthesized by Bacillus remained stable for 120 days without color change. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test was used to assess the antimicrobial activity of ZnO and N-ZnO NPs against Gram-positive (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ATCC 25923, and Listeria monocytogenes ATCC 7644) and Gram-negative (Escherichia coli Type 1, Escherichia coli O157:H7 NCTC 12900, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Enteritidis ATCC 13076 and Salmonella Typhimurium). The ZnO NPs perform well against a variety of food pathogens, including Gram-positive and Gram-negative. Additionally, N-ZnO NPs showed high efficacy against pathogenic bacteria compared to the action of ZnO NPs and free nisin alone; the inhibition zones formed by N-ZnO NPs at 10 mg/mL against Gram-negative bacteria were 16 mm and 15.8 mm for S. Enteritidis ATCC 13076 and P. aeruginosa respectively. In addition, results revealed that the N-ZnO NP has strong bactericidal activity in liquid media against pathogenic bacteria compared with ZnO NPs and free nisin, which killed 94.98 and 96.79 % of the L. monocytogenes ATCC 7644 and S. aureus ATCC 25923 respectively at 150 µg/ mL within 6 hours of treatment. As a result of this study, it was determined that Bacillus subtilis ZBP4, a local isolate, is a microorganism that can be used for biosynthesis ZnO NPs, and synthsized ZnO NPs can be a good antimicrobial agent. In addition, it has been demonstrated that when nisin is loaded to the biosynthesis medium, both the antibacterial and antioxidant properties of the synthesized nanoparticles can be significantly improved.