Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması

Abstract

Dünyada ve ülkemizde Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in neden olduğu sırasıyla kistik ekinokokkoz (KE) ve alveolar ekinokokkoz (AE) önemli helmint hastalıkları arasındadır. Türkiye'de yapılan epidemiyolojik çalışmalar KE prevalansının 291-585/100.000 arasında olduğunu göstermiştir. AE seroprevalansının da %3.5 oranında olduğu bildirilmiştir. KE ve AE tanısında klinik bulgular yanında genelde radyoloji (ultrason, bilgisayarlı tomografi , manyetik rezonans) ve serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Kesin tanı patolojik incelemeye dayalıdır. Hidatik kistlerin steril olması ya da protoskoleks içermemesi durumunda ise, patolojik tekniklerle E.granulosus ve E.multilocularis tür ayrımında zorluklar yaşanmaktadır. Bu çalışmada, aynı test içerisinde AE ve KE tanısının yapılmasına imkan verebilecek Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3') ve Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3') primerleri ve üç farklı prob; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-fl oresan-3'), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-fosfat-3') ve Multilocularis (5'-LC705CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-fosfat-3') kullanılarak, E.granulosus ve E.multilocularis mitokondriyal 12S rRNA genini hedefl eyen yeni bir multipleks gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (M-RTPCR) yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. M-RT-PCR sırasında, E.granulosus (GenBank: AF297617.1) ve E.multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitokondriyal 12S rRNA gen bölgelerini içeren plazmidler pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. M-RT-PCR yönteminin geliştirilmesinde ayrıca, patolojik olarak KE (n: 10) ve AE (n: 15) olduğu doğrulanmış hastalara ait kist örneklerinin yanı sıra, negatif kontrol olarak sağlıklı insan DNA örnekleri (n: 25) ve 12 farklı parazite (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) ait DNA örnekleri de çalışılmıştır. Testin analitik duyarlılığının saptanması için TOPO klonlama ile E.granulosus ve E.multilocularis pozitif kontrol plazmidleri oluşturulmuştur. Pozitif kontrol plazmidi, analitik duyarlılık ve özgüllüğün belirlenmesi amacıyla her reaksiyonda 106-105-104-103-102-101-1 plazmid kopya olacak şekilde distile su ile sulandırılmıştır. Çalışmamızın sonuçları, testin pozitif kontrol plazmidi kullanılarak elde edilen analitik duyarlılığının, E.granulosus ve E.multilocularis için 1 plazmid kopya/?l örnek olduğunu göstermiştir. Testin 12 farklı parazite ait DNA örneği ile çapraz reaksiyon vermemesi, analitik özgüllüğünü ortaya koymuştur. Yirmibeş hastaya ait kist örneğinde Echinococcus DNA varlığının gösterilmesi ve tür ayrımının yapılabilmesinin yanında, sağlıklı (negatif kontrol) insan DNA örnekleri ile çapraz reaksiyon vermemesi, testin klinik duyarlılık ve özgüllüğünün %100 olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen M-RT-PCR yönteminin, kist örneklerinde ekinokokkoz tanısının konulmasına ek olarak, E.granulosus ve E.multilocularis'in ayırt edilmesinde duyarlı, özgül, hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğu tespit edilmiştir

Cystic echinococcosis (CE) and alveolar echinococcosis (AE) caused by Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, respectively, are important helminthic diseases worldwide as well as in our country. Epidemiological studies conducted in Turkey showed that the prevalence of CE is 291-585/100.000. It has also been showed that the seroprevalence of AE is 3.5%. For the diagnosis of CE and AE, radiological (ultrasonography, computed tomography, magnetic resonance) and serological methods, in addition to clinical fi ndings, are being used. The defi nitive diagnosis relies on pathological examination When the hydatid cysts are sterile or does not contain protoscolex, problems may occur during pathological discrimination of E.granulosus and E.multilocularis species. In this study, we aimed to develop a novel multiplex real-time polymerase chain reaction (M-RTPCR) targeting mitochondrial 12S rRNA gene of E.granulosus and E.multilocularis using Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3') and Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3') primers and three different probes; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-fl uoroscein-3'), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-phosphate-3') and Multilocularis (5'-LC705-CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-phosphate-3') that will enable the diagnosis of CE and AE in same assay. During M-RTR-PCR, plasmids containing E.granulosus (GenBank: AF297617.1) and E.multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitochondrial 12S rRNA regions were used as positive controls. Cysts samples of patients which were pathologically confi rmed to be CE (n: 10) and AE (n: 15) and healthy human DNA samples (n: 25) as negative control as well as DNA samples of 12 different parasites (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) were used to develop M-RT-PCR. E.granulosus and E.multilocularis control plasmids were constructed to detect analytic sensitivity of the test using TOPO cloning. Positive control plasmids were diluted to determine analytical sensitivity and specifi city by distilled water at 106-105-104-103-102-101-1 plasmid copy of dilution in each reaction. According to the results, analytical sensitivity of the assay for E.granulosus and E.multilocularis was 1 copy plasmid/?l reaction. The non-existence of cross reactivity with 12 different parasites' DNA samples showed the analytical specifi city of the assay. Displaying Echinococcus DNA in cyst samples among 25 patients and species discrimination as well as non-existence of cross reactivity with human DNA samples showed that the clinical sensitivity and specifi city of the assay were 100%. As a result, the M-RT-PCR developed in the present study provided a sensitive, specifi c, rapid, and reliable method in the diagnosis of echinococcosis and the discrimination of E.granulosus and E.multilocularis from cyst samples